劳氏紫瑞利共振散射荧光法测定肝素钠

李志云，刘保生

(河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

肝素钠系自猪的肠黏膜或牛肺中提取精制的一种硫酸氨基葡聚糖钠盐，属黏多糖类物质. 本品具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用，主要用于防治血栓形成或栓塞性疾病(如心肌梗死、血栓性静脉炎、肺栓塞等)及各种原因引起的弥漫性血管内凝血，也用于血液透析、体外循环、导管术、微血管手术等操作及某些血液标本或器械的抗凝处理.

测定肝素钠的方法有光度法[1]，CdTe 量子点作探针共振瑞利散射色谱法[2]，修饰电极法[3]，高效液相色谱法[4]，电泳法[5]，电化学传感器[6]，生物法[7]和利用稀土测试肝素钠也有报道[8-10].本文在近中性的BR缓冲溶液中，由于劳氏紫与肝素钠反应形成离子缔合物，使得共振散射强度显著增强，据此对肝素钠注射液进行含量测定，方法准确、快速，对肝素钠的快速测定有一定的意义.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

RF-5301荧光光度计(日本岛津)；pHS-3型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司).

肝素钠(Heparin Sodium)对照品：准确称取肝素钠 0.1000 g用水定溶于100 mL容量瓶中，得质量浓度为1.0 g/L的溶液，放入冰箱中保存，用时稀释10倍.

5.0×10-4mol/L的劳氏紫水溶液；pH =6.5的BR缓冲溶液(Britton-Robinson,H3PO4-HAc-H3BO3).实验所用试剂皆为分析纯，水为蒸馏水.

1.2 实验方法

于10 mL比色管中，加入pH =6.5 BR缓冲溶液0.75 mL、5.0×10-4mol/L的劳氏紫溶液1.0 mL，一定量肝素钠溶液，以水定容，摇匀，静置15 min. 以Δλ=0(λem=λex)进行同步扫描，记录564 nm处体系的ΔI=I-I0值(体系散射光强度I、空白溶液I0).

2 结果与讨论

2.1 体系的共振谱图

按实验方法操作，结果见图1. 由图1可知，单独的肝素钠在测定条件下的RRS光谱较弱，劳氏紫在测定条件下无RRS信号. 在pH =6.5缓冲溶液中，劳氏紫为阳离子，肝素钠为阴离子，两者能通过静电引力结合. 因此，肝素钠与劳氏紫染料共存时，两者反应，造成体系瑞利共振散射信号增强，产生新的瑞利共振散射光谱，其最大峰出现在564 nm.

1-4.肝素钠的质量浓度分别为0， 0.40， 0.44， 0.47 mg/L图1 肝素钠与劳氏紫的共振光谱Fig.1 Resonance spectra of thionine with various concentrations of heparin sodium

2.2 酸度的影响

改变溶液酸度，按实验方法操作，考察pH值对体系RRS的影响，见图2. 由图2可以看出，pH在5.0～9.0时体系的RRS较大且稳定，据此选pH =6.5作为实验最佳酸度条件.

图2 酸度对劳氏紫-肝素钠体系荧光强度的影响Fig.2 Effect of acidity on fluorescence intensity of thionine-heparin sodium system

2.3 缓冲溶液用量

选用pH =6.5的BR缓冲溶液进行实验，结果表明用量在0.5 ～ 1.2 mL时劳氏紫-肝素钠体系的RRS最大且基本稳定，因此选0.75 mL为其最佳用量.

2.4 稳定性

按实验方法配制溶液，对体系的稳定性进行了连续测定，每次测定间隔3 min.结果表明，体系RRS在30 min内保持不变，据此选择静置时间15 min.

2.5 工作曲线

改变肝素钠溶液用量绘制工作曲线，其线性回归方程为:ΔI=0.125+16.88ρ(mg/L)，相关系数r=0.998 4，肝素钠的线性范围为0.025 ～ 0.500 mg/L.测定最佳条件下11份空白溶液的RRS强度，按3 σ/K法计算得方法检出限为9.16 μg/L，相对标准偏差是3.17%.

2.6 样品及回收率的测定

取不同厂家或批号的肝素钠注射液(标示量12 500单位/ 2 mL)进行含量测定，用移液管取0.1 mL于200 mL容量瓶中稀释，再移取该溶液0.1 mL按实验方法操作，平行6次测定其RRS强度值，以6次平均值作为测定结果并计算方法的相对标准偏差，同时加入0.2 mg/L肝素钠标准溶液进行回收率实验，结果见表1. 从表1可以看出，样品平行6次测定，方法回收率为104.0%～106.4%，相对标准偏差为1.67%～3.01%，均在允许范围内，表明结果令人满意，方法可行. 按140单位效价/mg折算注射液的肝素钠效价，其效价为108%～114%，符合药典规定效价应为标示量的86%～116%标准.

表1 样品测定结果(n =6)

参 考 文 献:

[1] 司文会, 解鹏, 訾言勤. 夜蓝褪色分光光度法测定肝素钠[J].理化检验-化学分册, 2010, 46(11): 1334-1336.

SI Wenhui, XIE Peng, ZI Yanqin. Spectrophotometric determination of heparin sodium salt by decoloration of night blue[J]. Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis), 2010, 46(11): 1334—1336.

[2] 闫曙光, 何佑秋, 彭娟娟, 等. CdTe量子点作探针共振瑞利散射法测定肝素钠[J].西南大学学报:自然科学版,2010, 32(3): 67-71

YAN Shuguang, HE Youqiu, PENG Juanjuan, et al. Resonance rayleigh scattering methed for determineation of heparin using CdTe QDs as the probe [J]. Journal of Southwest University:Natural Science Edition,2010, 32(3): 67-71

[3] 李晓霞, 李延清, 苗苗，等. 聚亚甲基蓝碳纳米管修饰电极测定肝素钠[J]. 河南科技大学学报:自然科学版,2011, 32(2): 97-100

LI Xiaoxiaa, LI Yanqing, MIAO Miao， et al. Determination of Heparin at Polymethylene Blue-Multiwalled Carbon Nanotube Modified Electrodes[J].Journal of Henan University of Science & Technology:Natural Science,2011, 32(2): 97-100

[4] 毛平, 黄晓兰, 李翠贞,等. 高效液相色谱法测定血浆肝素含量[J]. 中华医学检验杂志, 1995, 18(6): 358-360.

MAO Ping，HUANG Xiaolan，Li Cuizhen, et al. Determination of plasma heparin by high performance liquid chromatoagraphy(HPLC) and itsclinical application[J]. Chinese Journal of Medical Laboratory Sciences,1995, 18(6): 358-360.

[5] 丁侃, 方积年. 多糖类药物的毛细管电泳分析方法及其应用[J]. 色谱, 1999, 17(4): 346-350.

DING Kan, FANG Jinian. Capillary electrophoresis of polysaccharides and its application[J].Chinese Journal of Chromatography, 1999, 17(4): 346-350.

[6] 张莉, 李娜, 赵凤林,等. 糖胺聚糖分析测定的研究进展[J]. 分析化学, 2005, 33(7): 1023-1028.

ZHANG Li, LI Na, ZHAO Fenglin，et al. Research progress on glycosaminoglycans analysis[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33(7): 1023-1028.

[7] 人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典第二部[M]. 北京: 化学工业出版社, 1995: 307-311.

[8] LUO Hongqun, LIU Shaopu, LIU Zhongfang, et al. Resonance rayleigh scattering spectra for studying the interaction of heparin with some basic phenothiazine dyes and their analytical applications[J]. Analytical Chimica Acta，2001, 449(1-2): 261-270.

[9] WEI Wei, WANG Hong, JIANG Chongqiu. Sepctrofluorimetric determination of trace heparin using lomefloxacin-terbium probe[J]. Spectrochimica Acta Part A，2006, 63(2): 241-246.

[10] LI Jing, LIU Jinkai, ZHU Xiaojing, et al. Spectrofluorimetric determination of heparin using doxycycline-europium probe[J]. Journal of Luminescence，2005, 113(3-4): 305-313.