生物素化胆甾醇基普鲁兰糖合成及其自聚集性质

杨文智，王苗苗，李海鹰，马丽兰，李霞霞

(河北大学 药学院，河北 保定 071002)

高分子材料用作药物的纳米载体，可增大药物溶解度，改善药物生物利用度，达到缓释或靶向作用，为肿瘤治疗提供了一种新方法．近年来，文献报道采用新型高分子材料制备载药微球、脂质体或纳米粒，作为药物的新型传递系统[1-3]．

普鲁兰糖是中性直链多糖，具有易溶、安全、无毒、生物相容与降解性好和多羟基易化学修饰等优点，备受研究者关注[4]．接枝改性普鲁兰糖是其研究的热点之一，文献报道用聚酯[5]、酰基[6]或聚乙二醇[7]等对多糖链进行接枝改性，制备两亲性普鲁兰糖高分子材料，得到材料可在水中自聚集成纳米粒，用于负载药物和多肽，实现药物的可控和靶向释放．胆甾醇基普鲁兰糖(CHSP)是一种新型两亲性材料，其自聚集纳米粒可负载抗肿瘤药物或作为蛋白药物分子伴侣，实现药物的体外缓释及被动靶向作用[8-11]．但其与组织或细胞缺少特异性结合，难以实现主动靶向．肿瘤组织生长需大量生物素，相比正常细胞，肿瘤细胞表面有大量生物素受体，导致其更易识别结合生物素．生物素化学键合纳米载体可主动靶向传递抗瘤药物[12]．文献报道，生物素化纳米颗粒与乳腺或宫颈肿瘤细胞共孵育，肿瘤细胞摄取纳米粒量优于未接生物素的纳米粒[13]．

基于以上原因，本文设计将生物素键合到CHSP材料上，获得适宜取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰(Bio-CHSP)两亲性材料，希望获得其自聚集纳米粒，为下一步负载抗肿瘤药物，实现生物素介导载药纳米粒的主动靶向作用提供实验支持.

1 实验材料

核磁共振仪(瑞士布鲁克公司，型号：Bruker AVANCE Ⅲ 600)；X线粉末衍射仪(德国布鲁克公司，型号：D8 Advance)；荧光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司, 型号：970CRT)；动态激光粒度分析仪(美国贝克曼库尔特公司，型号：Delsa Nano zeta)；气浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂，型号：THZ-82)；透射电镜(日本电子株式会社, 型号：JEM-100C)；LCD探头超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SCIENTZ JY 92-Ⅱ)．

胆甾醇基普鲁兰糖(CHSP)参考文献[14]合成，胆甾醇的取代度为5.4%；生物素(国药集团化学试剂有限公司，上海)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/EDC· HCL(Sigma Co. USA)；4-二甲氨基吡啶(DMAP， Sigma Co. USA)；芘(Aldrich Co. USA)；透析袋(截留相对分子质量为8～14 ku，美国)；其余试剂均为分析纯．

2 实验方法

2.1 生物素化胆甾醇基普鲁兰糖(Bio-CHSP)材料的合成

2.1.1 材料合成方法

取胆甾醇基普鲁兰糖(CHSP)0.5 g和适量生物素溶于4 mL 二甲基亚砜(DMSO)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC· HCL)(n(EDC)/n(生物素)=1.2)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)((n(DMAP) /n(生物素)=0.1)，45 ℃反应5 d．反应结束，反应液滴入体积分数95%乙醇中，抽滤，滤饼分别用二氯甲烷、稀碱液和无水乙醇洗涤，干燥，即得生物素化胆甾醇基普鲁兰糖，备用．材料的合成路线见图1．

2.1.2 X线粉末衍射分析

生物素、CHSP、Bio-CHSP和生物素与CHSP的物理混合的干燥样品在2θ为5～80°内扫描样品的X线粉末衍射图谱．

2.1.3 氢核磁测定与材料生物素取代度确定

生物素、CHSP和Bio-CHSP样品溶于DMSO-d6，置于AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振仪中，测定样品的氢核磁图谱．采用1HNMR法测定生物素的取代度，计算每100个葡萄糖残基上偶联生物素个数．

2.2 Bio-CHSP 纳米粒的制备及表征

透析法制备Bio-CHSP自组装纳米粒[7]．称取不同取代度的Bio-CHSP材料适量溶于DMSO中，转移到截留相对分子质量8～14 ku的透析袋中，置于1 000 mL蒸馏水中透析9 h，透析完毕，定容，100 W探头超声2 min，即得自组装纳米粒，备用．将制得的自组装纳米粒溶液制样，采用透射电镜(TEM)观察形态；利用动态激光粒度分析仪(DLS)测其粒径分布及Zeta电势．

2.3 临界聚集浓度(CAC)的测定

取 10 mL容量瓶，加入适当浓度的芘-甲醇溶液，氮气吹干，分别加入精密配制的不同浓度的Bio-CHSP 纳米溶液，使芘最终浓度为6×10-7mol/L，37 ℃恒温振荡1 h．荧光测定样品，激发波长334 nm，发射光谱扫描300～500 nm，激发与发射狭缝宽度分别为5 nm和2 nm，记录372 nm和383 nm处的荧光吸收强度(I)，以I372/I383对浓度ρ(mg/mL)的logρ作图，计算CAC．

3 结果与讨论

3.1 Bio-CHSP的合成与表征

Bio-CHSP衍生物的合成路线见图1，EDC·HCl作为脱水剂和偶合剂，DMAP作为催化剂，通过酯化反应将生物素连接于胆甾醇基普鲁兰多糖上，获得Bio-CHSP．

图1 Bio-CHSP合成路线Fig.1 Synthesis route of Bio-CHSP

图2为生物素、CHSP和Bio-CHSP 的1HNMR谱．文献报道CHSP氢核磁数据[14]：0.40～1.20(胆甾醇骨架氢)，2.49(DMSO-d6)，2.53(琥珀酰2个亚甲基峰，—OCH2CH2O—)，2.60～4.60(糖环上C2,C3,C4,C5,C6氢峰)，4.60(C1，1H，α-1,6)，5.05(C1，1H，α-1,4)，4.60～5.40(羟基吸收峰，—OH)． Bio-CHSP氢谱中除CHSP 的特征峰外，出现生物素特征峰，如：1.20～1.80(a, 6H, —(CH2)3—, m)，4.17(b, 1H, dd), 4.32(c, 1H, m) 和6.45(d, 2H, =N—H, brs)；由于生物素化学键合到CHSP糖链上，6.45脲(—NH—CO—NH—)吸收峰为宽单峰，明显有别于单独的生物素氢核磁峰．同时，Bio-CHSP氢谱上未见12.0处羧基峰(—COOH)[15]；这些氢核磁数据表明，生物素成功接枝到胆甾醇基普鲁兰多糖链上．

普鲁兰多糖由单糖通过α-1,4和α-1,6糖苷键连接而成． Bio-CHSP 氢谱的4.17(b, 1H, dd)和4.32(c, 1H, m)的“=CH—”核磁峰明显且无干扰，故CHSP多糖链接枝生物素取代度可按如下公式(1)计算，A代表在某化学位移处峰面积，不同投料比合成Bio-CHSP材料的生物素取代度(DS)见表1．

×100. (1)

a生物素与CHSP投料物质的量比；bDLS测定Bio-CHSP纳米粒粒径(Dh)及粒径分布(PDI)；c荧光法测定不同取代度Bio-CHSP材料水中的临界聚集浓度；dDLS测得水中自聚集Bio-CHSP 纳米粒的(ζ)电势.

A.生物素；B.CHSP；C.Bio-CHSP.图2 氢核磁共振图谱Fig.2 1HNMR spectra

A.生物素;B.CHSP;C.Bio-CHSP;D.a与b物理混合(质量比1∶10).图3 X衍射谱Fig.3 Xray diffraction patterns

生物素、CHSP、Bio-CHSP和生物素与CHSP混合样品的X粉末衍射图谱，见图3．生物素在2θ为8.4，12.1，17.7，18.8，21.3，22.5，28.5，34.1°处显示出尖锐特征峰，表明其为小分子结晶态．CHSP与Bio-CHSP材料均为非晶态，CHSP 在2θ为17.9°处具有宽衍射峰，而Bio-CHSP 宽衍射峰出现在18.7°处；生物素与CHSP物理混合样品的图谱中存在明显尖锐的生物素特征峰．由上可知，生物素化学键合到CHSP多糖链上[16]．

1HNMR 与X线粉末衍射数据分析，证明生物素化胆甾醇基普鲁兰糖的合成．

3.2 透射电镜及粒径分析

具有适宜生物素取代度的Bio-CHSP可在水中自聚集形成纳米凝胶，纳米粒子呈圆形或椭圆形，结果见图4．图 4a是Bio-CHSP-2自组装纳米粒的透射电镜图．从图中可以看出纳米粒成球形，粒径约为150 nm，分散比较均匀．不同生物素取代度的Bio-CHSP自聚集纳米粒子的粒径和Zeta电位见表1．Bio-CHSP自组装纳米粒在水中自聚集粒径为100～180 nm．自聚集纳米粒的粒径与生物素取代度有关，取代度增大，粒径变小，即疏水性强，利于Bio-CHSP自聚集纳米粒形成更紧密的疏水核心，导致纳米粒粒径减小．DLS测得的自聚集纳米粒粒径较 TEM 观察的粒径大，粒径分布见图4b．透射电镜测定的是自聚集纳米粒干态粒径，DLS测定自聚集纳米粒水合粒径，故同一样品DLS测定粒径偏大．Bio-CHSP自聚集纳米粒Zeta 电位呈现负值．

a.透射电镜照片；b.DLS粒径分布.图4 Bio-CHSP纳米粒Fig.4 Bio-CHSP-2NPs

3.3 临界聚集浓度(CAC)的测定

在溶液体系中，芘分子自发地由极性环境向非极性环境转移，当溶液体系的极性发生变化，即非极性环境变强，可使荧光检测信号显著增强.实验选择芘作为荧光探针，水溶液芘浓度低于10-5mol/L，其在372，379，383，390，397 nm处出现激发态荧光的5重发射峰，第1与第3发射峰强度比(I372/I383)常用作芘“极性标尺”，反映芘所处环境的极性状况．一般通过I372/I383的比值大小来推测溶液中胶束浓度的变化．利用此原理，可评价水中高分子胶束的疏水结构域的生成状况．亲水普鲁兰糖长链化学键合疏水胆甾醇及生物素基团，当疏水基适宜取代，材料则显双亲性质．故本实验采用芘为荧光探针，应用稳态荧光探针法，评价Bio-CHSP材料两亲性强弱，并测定其自聚集水凝胶纳米粒的临界聚集浓度(CAC)[17]．见图5，将不同浓度的Bio-CHSP 胶束溶液下测定的I372/I383与logρ作图，对曲线两端线性拟合，其交点浓度即为Bio-CHSP自聚集纳米粒的CAC值，结果见表1．接枝糖链的生物素增多，疏水作用力增强，Bio-CHSP易发生自聚集，表现为CAC值减小[18]．

■ Bio-CHSP-1； ●Bio-CHSP-2.图5 Bio-CHSP 芘荧光发射光谱I372/I383与logρ之间的关系Fig.5 Intensity ratio (I372/I383) from excitation spectra of pyrene (6.0×10-7mol/L) with various concentrations of Bio-CHSP

4 结论

成功合成并表征了不同生物素取代的胆甾醇基普鲁兰糖衍生物，合成材料具备两亲性，可在水中自聚集成球形纳米粒，获得的Bio-CHSP材料纳米粒用作抗瘤药物载体及其生物学效应评价正在实验中．

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