氯嘧磺隆分子印迹聚合物的合成及其性能

陈萍，孟红莲，蔡青红，郭欣，陈冠华

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

氯嘧磺隆是一种具有低毒、高效、低残留特点的磺酰脲类除草剂，广泛地应用于农业生产[1].随着对食品安全关注度的提高，欧盟、日本、美国等发达国家和地区对包括磺酰脲类除草剂在内的各种农药残留的控制越来越严格.日本肯定列表规定干大豆中的氯嘧磺隆的最大残留限量(MRL)为0.05 mg/kg，干花生中为0.02 mg/kg，毛豆中为0.05 mg/kg.因此建立高选择性和高灵敏检测方法的研究从未停止.对磺酰脲类除草剂残留的检测方法主要为分离分析方法[2-7].在这些方法中，气相色谱法对热不稳定的磺酰脲类除草剂必须进行衍生化处理；报道较多的液相色谱法则由于检测灵敏度问题，多需要对样品进行富集预处理[1]；即使采用灵敏度较高的液相色谱-质谱联用法，仍需对复杂的样品进行净化处理[8].

鉴于分析方法的发展现状及氯嘧磺隆使用量少和残留低的特点，对其在食品和环境样品中残留的提取、富集和净化成为制约其分析检测的瓶颈.传统的液-液萃取、索氏提取等技术可用于氯嘧磺隆的前处理，但是存在有机溶剂使用量大、步骤过于繁琐等缺点[9].使用非选择性填料(如C18)的固相萃取虽可避免这些缺点，但存在回收率低和净化不彻底的问题[10].因此，制备可用于对氯嘧磺隆残留进行选择性提取的固相萃取柱填料是十分必要的[11].

分子印迹聚合物(MIPs)是一种由若干功能单体分子通过聚合与交联而形成的高分子聚合物，它能够通过特定的键位与印迹分子形成可逆结合的分子复合体系.印迹分子通过共价或非共价键与功能单体溶解在一起，再通过交联剂聚合形成一种高度交联的聚合网络，最后从聚合网中移走模板分子.聚合物上特定的识别位点与模板分子互补，当模板分子流经此聚合物时，将产生特异性识别.分子印迹聚合物通过与模板分子或其他结构类似物再成键，显示出了其高度的选择性[12-13].MIPs是化学方法合成的聚合物，具有天然特异性识别分子所不具备的适应性广、稳定性高、使用寿命长等诸多优点[14].因此，它不仅在化学领域具有广阔前景，而且在包括生物学和医学等许多领域都具有广阔应用前景.利用此项技术有望制备出上述可对氯嘧磺隆进行选择性提取的固相萃取柱填料.汤凯洁等[8]以苄嘧磺隆为印迹分子制备了印迹聚合物，并将其用于液相色谱-质谱联用中的样品净化.但以氯嘧磺隆为印迹分子制备分子印迹聚合物的研究尚未见报道.本文对以氯嘧磺隆为模板分子制备微球形MIPs进行了研究，并对其吸附性能和可重复利用性能进行了研究，为利用其对食品和环境样品中氯嘧磺隆的提取提供了理论依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；索式抽提器(华东化玻有限公司)；WW-1601 紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；HH-S8 数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；B5500S-MT 超声清洗机(上海必能信超声有限公司)；恒温水浴振荡器(江苏金坛市中坛仪器厂)；JSM-7001F场发射扫描电子显微镜(日本Jeol).

氯嘧磺隆(CME，纯度95%)由镇江先锋化学有限公司友情提供；甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、乙腈、甲醇、冰乙酸均为AR级试剂.MAA，EGDMA使用前需经减压蒸馏提纯，MAA的馏分温度为60～63 ℃，EGDMA馏分温度为98～100 ℃，AIBN用甲醇重结晶后使用.

1.2 分子印迹聚合物微球的制备

准确称取模板分子CME和功能单体MAA溶于一定量的乙腈中，超声10 min，在常温下振荡5 h，使模板分子和功能单体充分反应，然后依次加入交联剂EGDMA和25 mg引发剂AIBN，混合均匀，真空封管，置于60 ℃水浴锅反应24 h.所得的聚合物置于索氏抽提器中，加入100 mL体积比为10%的乙酸甲醇溶液洗去模板分子，调节恒温水浴锅的温度，使其抽提室中的洗脱溶剂每45 min循环1次，洗脱至用紫外吸收方法检测不到模板分子为止.对过量的乙酸用甲醇进行洗脱，然后转移至真空干燥器中干燥，直至恒重.非印迹聚合物(NIP)除不加模板分子外，其他制备步骤与MIP相同.

1.3 氯嘧磺隆印迹聚合物微球吸附特性测定方法

1.3.1 紫外光谱分析和标准曲线

固定氯嘧磺隆在乙腈中的浓度为0.02 mmol/L，分别加入不同摩尔的功能单体MAA，配制氯嘧磺隆和功能单体浓度比为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8系列溶液.超声混合10 min，置于暗处过夜.再用1 cm的石英比色皿以含有相应浓度的MAA、乙腈溶液为参比，测定各试液的紫外吸收光谱.

准确称取0.020 7 g氯嘧磺隆，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得5 mmol/L的标准储备液.准确吸取一定体积的标准储备液分别配成0.3, 0.5,1,2,3,4,5 mmol/L的标准工作液，用紫外可见分光光度计在氯嘧磺隆最大吸收波长(233 nm)下测定吸光度，以样品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线.

1.3.2 聚合物微球吸附量的测定

称取氯嘧磺隆MIP微球及相应的NIP微球0.02 g，分别置于10 mL比色管中，加入2 mL浓度为5 mmol/L的氯嘧磺隆乙腈溶液，在室温下振荡24 h后，在10 000 r/min下离心10 min，取上层清液过0.45 μm滤膜，于233 nm检测吸附后溶液中的氯嘧磺隆浓度.根据氯嘧磺隆浓度的变化，利用Q= (c0-ct)V/m计算出微球对模板分子的吸附量Q(μmol/g).其中c0为氯嘧磺隆的初始浓度(mmol/L)，ct为吸附平衡后氯嘧磺隆的浓度(mmol/L)，V为溶液的体积(mL)，m为印迹聚合物的质量(g).平行测定3次后，取平均值.

1.3.3 聚合物微球吸附等温线的测定

分别称取一组等量的MIP和NIP，每份0.02 g，分别置于10 mL比色管中，加入2 mL浓度为0.5～5 mmol/L的氯嘧磺隆乙腈溶液，在室温下振荡24 h后，在10 000 r/min下离心10 min，取上层清液过0.45 μm滤膜，于233 nm检测吸附后溶液中氯嘧磺隆的浓度.根据氯嘧磺隆浓度的变化，利用Q= (c0-ct)V/m计算出印迹微球对模板分子的吸附量Q(μmol/g).平行测定3次后，取平均值.以氯嘧磺隆初始浓度c为横坐标，以吸附量Q为纵坐标，绘制吸附等温线.

1.3.4 氯嘧磺隆印迹聚合微球吸附动力学测定方法

分别准确称取质量均为0.02 g的MIP于一组10 mL比色管中，分别加入5 mmol/L氯嘧磺隆乙腈溶液2 mL，在室温下分别振荡0,15,30,60,90,120,150,180,240,300,360,420,480,540,600 min，然后以10 000 r/min离心10 min，将上清液过0.45 μm滤膜，用紫外吸收分光光度计检测平衡吸附液中氯嘧磺隆浓度.将吸附前后氯嘧磺隆的浓度值代入Q= (c0-ct)V/m，计算出印迹微球对氯嘧磺隆的吸附量Q(μmol/g).平行测定3次后，取平均值.

1.3.5 聚合物微球重复使用性能的测定

将已吸附的氯嘧磺隆乙腈溶液的印迹聚合物微球，通过体积分数10%乙酸甲醇溶液洗去模板分子，用甲醇洗涤除去残留的乙酸，放入真空干燥器至恒重.在5 mmol/L的氯嘧磺隆乙腈溶液中进行再次吸附，测定其吸附容量Q(μmol/g).平行测定3次后，取平均值[15].

2 结果与讨论

2.1 氯嘧磺隆印迹微球合成条件的优化

2.1.1 模板与功能单体配比的优化

首先在5 mL试管中加入0.004 mmol模板分子CME，逐渐增加MAA的用量，使CME与MAA的物质的量比为1∶2,1∶4,1∶6,1∶8，用乙腈稀释至0.02 mmol/L，超声混合30 min，置于暗处过夜，以相应浓度的MAA为空白对照，在233 nm处测定其吸光值，结果如表1所示.随着物质的量比的增加，通过氢键相互作用形成的CME与MAA的缔合物逐步增多，溶液中游离的CME逐步减少，导致吸光度下降,在1∶6时达到最低点；但当物质的量比继续增大时，吸光度又会重新增大，这可能与过多的MAA自身相互缔合，造成CME与MAA缔合的空间位阻增大而使游离CME重新增多有关[16].

表1 模板分子与功能单体相互作用对吸光度的影响

其次，分别以上述CME与MAA的物质的量比合成MIP，做相应的吸附实验,结果如图1所示.当模板分子与功能单体的配比为1∶6时，所制备的MIP吸附量Q最大.这与上述表1的预测结果一致，从实际的印迹效果上证明了其结论的正确性.

2.1.2 溶剂用量的优化

溶剂的用量直接影响聚合物的浓度，从而会影响MIP的识别能力.当溶剂用量较少时，聚合物溶液的浓度较大，使得溶液黏度变大，导致分子在聚合开始一段时间后移动困难，模板被聚合物链包裹程度降低，印迹效果因此受到影响.当溶剂用量较多时，聚合物溶液浓度较低，聚合反应速率变慢，反应时间延长，且形成的聚合物中空穴结构不稳定，同样使吸附量受到影响[15,17].本实验中，取0.25 mmol的 CME，1.5 mmol的MAA，按照1.2所述方法制备分子印迹微球，再通过1.3.2的方法测定各组的吸附量.溶剂用量对吸附量的影响结果如图2所示，当溶剂的体积为30 mL时，MIP对氯嘧磺隆有较好的吸附性能.

图1 模板分子与功能单体物质的量比对分子印迹 图2 溶剂的用量对分子印迹聚合物吸附性能的影响 聚合物吸附性能的影响 Fig.2 Effect of solvent volume on adsorptionFig.1 Effect of molar ratio of template and MAA capacity of MIP on adsorption capacity of MIP

2.1.3 模板与交联剂配比的优化

为了使合成的MIP具有一定的刚性，并能形成稳定的结合位点，通常需要添加一定量的交联剂，使聚合物形成一定的空间网络结构.当模板分子被洗脱后，形成的识别位点能可逆结合模板分子[18].同时，印迹聚合物还应具有一定的柔性，以便于目标分子进入孔穴，利于快速结合.因此交联剂的加入量既不能太少也不能太多.EGDMA 为最常用的交联剂，用EGDMA 所制备的分子印迹聚合物的孔穴很容易让目标分子接近，可以使孔穴与模板分子的结合迅速达到平衡[17].

氯嘧磺隆与EGDMA 配比对分子印迹微球吸附性能的影响如图3所示，随着EGDMA量的增大，MIP的吸附量逐渐增大，然而当模板分子与交联剂的物质的量比达到1∶20后，随着EGDMA用量的增加，MIP吸附量逐步下降.这是因为当交联剂用量较低时，形成的有效吸附位点不足，导致分子印迹微球对模板分子的吸附量较小；随着EGDMA 比例的增大，印迹聚合物的交联度增大，有效的印迹位点数得到很好地保留，MIP对氯嘧磺隆的吸附量增加；然而当氯嘧磺隆与EGDMA 的物质的量比超过1∶20 时，MIP的吸附量下降，这是因为此条件下所制备的聚合物柔性变差，CME不易进入孔穴，导致传质速率降低.因此选择氯嘧磺隆与EGDMA 的物质的量比为1∶20.

2.2 氯嘧磺隆分子印迹聚合物微球的结合能力

2.2.1 聚合物吸附等温线

在0.5～5 mmol/L内，按照1.3.3步骤测定MIP对氯嘧磺隆的吸附等温线，结果如图4所示.吸附等温线反映了模板分子的平衡吸附量随其浓度的变化关系.图4结果表明，MIP吸附量随模板氯嘧磺隆浓度的增加而增大，当其增加到4.5 mmol/L时，MIP吸附量增加趋势减弱；而NIP在此浓度范围内吸附量随起始浓度的增大而呈非饱和趋势增加，表明存在非线性增加的非特异性结合.

图3 模板分子和交联剂的物质的量比对印迹 图4 印迹和非印迹聚合物的吸附等温线 微球吸附性能的影响 Fig.4 Adsorption isotherm of MIP and NIP Fig.3 Effect of molar ratio of template and EGDMA on adsorption capacity of MIP

2.2.2 Scatchard方程

分子印迹中常用Scatchard[19]方程评价MIP的结合特性，其公式如下：

Q/c= (Qmax-Q) /Kd，

(1)

式中Qmax为最大表观结合量，Kd为结合位点的平衡解离常数，c为CME在吸附液中吸附平衡后的浓度.利用图4中MIP数据，以Q为横坐标，Q/c为纵坐标作图可得图5.在所研究的氯嘧磺隆浓度范围内Q/c对c呈现非线性关系，对两端线性部分分别拟合，可得到2个线性方程

Q/c=-1.525Q+96.782，

(2)

Q/c=-0.0909Q+39.735.

(3)

由于式(2)和式(3)中的斜率和截距分别为-1/Kd和Qmax/Kd，可求得高亲和性吸附位点的最大表观吸附量Qmax1为63.46 μmol/g，平衡常数Kd1为0.655 7 mmol/L；低亲和力吸附位点的最大表观吸附量Qmax2为437.085 μmol/g，平衡常数Kd2为11.00 mmol/L.

2.3 氯嘧磺隆分子印迹聚合微球的吸附动力学

参照1.3.4方法测定吸附不同时间后MIP吸附量，结果如图6所示.随着时间的增加，MIP的吸附量也逐渐增大，但增加到一定时间后，吸附量增加趋势变缓，420 min后由于MIP微球的空穴逐渐被氯嘧磺隆模板分子占据，吸附量最终达到饱和，不再随时间的变化而变化.但是NIP达到吸附平衡的时间更短，这是由于NIP没有特异性结合位点，根据图6可知其饱和吸附量远小于MIP，因此NIP达到饱和吸附的时间小于MIP.

图5 分子印迹聚合物吸附性能的Scatchard分析 图6 MIP和NIP的动态吸附曲线 Fig.5 Scatchard anaiysis on adsorption capacity of MIP Fig.6 Dynamic adsorption curve of MIP and NIP

2.4 氯嘧磺隆分子印迹聚合物微球印迹效果评价

印迹效果可用IPB(imprinting-induced promotion of binding)值[20]来评价，其公式如下：

(4)

其中QMIP为MIP 对于模板分子的吸附量(μmol/g)，QNIP为NIP对于模板分子的吸附量(μmol/g).聚合物对模板分子的IPB 值越大，说明MIP 的印迹效果越好.在氯嘧磺隆的乙腈溶液浓度为5 mmol/L 时，分别测定MIP 和NIP 的吸附量，计算得IPB 值为124.49%，印迹效果良好.

2.5 重复使用性能

对MIP微球按1.3.5方法反复操作10 次，以再生次数为横坐标，吸附容量为纵坐标得到图7.经过10次重复使用后，氯嘧磺隆印迹微球仍维持较好的吸附性能，无明显下降趋势.说明实验制备的MIP 具有重复使用的性能，有望用于固相萃取和色谱柱的填料.

2.6 氯嘧磺隆分子印迹聚合物微球的形态

对氯嘧磺隆印迹的聚合物微球进行扫描电子显微镜观察，所得图像如图8所示.可看出采用沉淀聚合法合成的MIP是以较为规则和均匀的球体形态存在，粒径为4.5～5.0 μm.

图7 使用次数对MIP吸附性能的影响 图8 MIP微球的扫描电子显微镜图像 Fig.7 Effect of reuse times on adsorption of MIP Fig.8 SEM image of MIP microspheres

3 结论

在氯嘧磺隆、MAA、EGDMA用量分别为0.25,1.5,5 mmol(物质的量比1∶6∶20)，乙腈用量30 mL，AIBN 用量0.30 mmol，聚合温度为60 ℃，聚合时间24 h条件下，可制备出具有最佳吸附性能的氯嘧磺隆MIP微球.该MIP存在2类不同性质的亲和性吸附位点，高亲和性吸附位点的最大表观吸附量Qmax1为63.46 μmol/g，平衡常数Kd1为0.655 7 mmol/L；低亲和力吸附位点的最大表观吸附量Qmax2为437.085 μmol/g，平衡常数Kd2为11.00 mmol/L.本制备方法具有无需研磨筛分即可得到分子印迹微球的特点，便于作为固相萃取柱和色谱柱的填料使用，重复使用9次吸附性能无显著下降，具有用于食品和环境样品中的痕量氯嘧磺隆除草剂残留富集和净化的潜力.

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