UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

吕延成，潘晓瑜，黄 畅，丁 娟

(遵义医学院 珠海校区，广东 珠海 519040)

Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2, HSV-2)是人类常见疾病的病原体之一，主要引起生殖器部位或新生儿感染。HSV-2的UL54和UL29基因在病毒感染过程中起重要作用，为HSV-2病毒复制所必需。UL54基因属于HSV-2立即早期基因，编码的ICP27蛋白是一种多功能蛋白，主要调节病毒和宿主细胞mRNA的合成、成熟和运输[1]，ICP27蛋白一旦突变可影响病毒在宿主内的复制[2-3]。UL29基因编码ICP8蛋白属单链DNA结合蛋白，参与病毒复制过程中的DNA解链， ICP8蛋白表达受到抑制可影响HSV-2晚期基因的表达[4-6]。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由内源性或外源性双链RNA介导的一种转录后的基因沉默。针对目标基因设计、构建带有启动子的重组表达质粒，转录出短发夹链RNA(small hairpin RNA, shRNA)，可以特异的抑制目标基因表达。本实验通过构建pGPU6/GFP/Neo-UL54-shRNA、pGPU6/GFP/Neo-UL29-shRNA重组表达质粒，对HSV-2的UL54、UL29同时进行干扰，分析采用双基因干扰方式对HSV-2病毒复制的影响，探讨沉默UL54和UL29基因在抑制HSV-2过程中可能的协同作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 人胚肾293细胞(HEK293)和主要试剂由校区分子生物学研究室提供，TRIzol、SYBR®PrimeScript®RT-PCR Kit购自中国大连宝生物工程有限公司， Lipofectamine2000购自Invitrogen公司， ICP27、ICP8单克隆抗体购自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 利用shRNA在线设计软件、Blast检索和RNA structure 5.0软件筛选UL54和UL29基因的干扰位点 UL54基因的干扰位点：1081-1101，序列GCGTGGTGCAAGATGTGCATT；UL29干扰位点：1461-1481，序列GCACCGGTTGGAATTGATTGC。同时设阴性对照(Negative control，NC)：序列 GTATGACAACAGCCTCAAG，序列由上海吉玛制药技术技术有限公司化学合成。使用T4 DNA连接酶将退火后的寡核苷酸双链插入到被BamH I 和Bbs I双酶切的原始载体pGPU6/GFP/Neo中。对构建的表达质粒pGPU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29进行双酶切鉴定，确定质粒构建正确。

实验分为对照组和干扰组。对照组包括空白对照组(pGPU6/GFP/Neo空载体)、阴性对照组(shRNA NC)和内参对照组(shRNAGAPDH)，干扰组包括UL54 shRNA、UL29 shRNA单基因干扰组和UL54 shRNA+UL29 shRNA双基因干扰组。

采用脂质体转染法，利用转染试剂lipofectamin2000将质粒转入HEK293细胞。取HEK293细胞接种于24孔板(4～5×104个/孔)，加入100μL质粒/lipofectamin2000复合物，37℃，5%CO2培养箱中培养48h。弃细胞培养液后，加100μL TCID50HSV-2病毒悬液，37℃，5%CO2培养箱中培养。48h后收集细胞上清液，终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度，MTT法检测细胞的存活率(每组设3个复孔)。

1.2.2 病毒感染48h后提取细胞总RNA，荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达 PCR引物设计序列如下：GAPDH： F-5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，R-5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；UL54：F-5'-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3'，R-5'-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3'；UL29：F-5'- GCCAGGAGATCGACGTGTITTCG-3，R-5'- CGCGCTGTTCATCGTTCCGAAG-3'。反应条件：95℃预变性5 min， 95℃变性20 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s， 40个循环，72℃再延伸10min。以管家基因GAPDH作为内参标准， 2-△△Ct计算mRNA表达量。

1.2.3 Western-blot检测UL29、UL54蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、半干式电转至PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭，加入一抗，二抗，化学荧光法(ECL)显色，曝光。以管家基因GADPH为内参蛋白表达标准，用Quantity One定量分析软件分析对Western blot图谱进行分析。

2 结果

2.1 子代病毒滴度和细胞存活率 细胞接种HSV-2 48h后，终点滴定法测定的上清子代病毒滴度用TCID50表示。接种病毒48h后，MTT法检测细胞的存活率，细胞存活率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%(见表1)。

表1转染后各组的病毒滴度和细胞存活率

组别病毒滴度 (IFU/100μL) 细胞存活率 (%) 空白对照10-6.7±0.530.52±4.28阴性对照10-6.3±0.233.54±3.68▲UL54 shRNA10-3.0±0.1*80.26±4.69*UL29 shRNA10-3.2±0.2*76.49±4.33*UL54shRNA+UL29 shRNA10-2.9±0.1 *#88.64±3.42*#

▲与空白对照组相比P>0.05；*与空白对照组相比P<0.01；#与单基因干扰组相比P<0.01。

由表1可以看出，阴性对照组与空白对照组相比病毒滴度、细胞存活率没有显著性改变(P>0.05)；单基因干扰组和双基因干扰组与空白对照组相比，病毒滴度都有不同程度减低，而细胞存活率明显增高，差异性显著(P<0.01)。双基因干扰组(UL54shRNA + UL29shRNA)与各单基因干扰组相比，病毒滴度下降、细胞存活率升高(P<0.01)。

2.2 表达载体对UL54 、UL29 基因表达的抑制效果 接种HSV-2 48h后，采用荧光定量PCR和Western blot检测目的基因的表达。用Comparative Delta-delta相对定量法，以空白组为对照计算干扰组mRNA的表达抑制率。各干扰组对病毒目的基因mRNA的抑制率和蛋白相对表达量的结果(见表2)，Western blotting结果(见图1)。

A：a:UL54shRNA1081+UL29shRNA1461；b:UL54sh RNA1081;c:Nrgsitive contyol；B：a：Nrgsitive contyol;b:UL29shRNA1461;c:UL54shRNA1081+UL29shRNA1461。图1 Western-blot检测ICP27和ICP8蛋白的表达结果

从表2可以看出：接种病毒48h后，与单基因干扰组比较，UL54 shRNA+UL29 shRNA双基因干扰组，对UL54基因mRNA的抑制率和对UL29基因mRNA的抑制率都明显升高(P<0.01)，而蛋白表达量也明显减少(P<0.01)。

表2转染后各组的病毒mRNA和蛋白表达抑制率

组别mRNA 抑制率(%) UL54UL29蛋白质表达率(%)ICP27ICP8 阴性对照6.325.3989.6585.31UL54 shRNA69.61*-61.27*-UL29 shRNA-66.08*-59.79*UL54shRNA+UL29 shRNA82.56*#74.63*#41.83*#36.58*#

*与阴性对照组相比P<0.01；#与单基因干扰组相比P<0.01。

3 讨论

RNA干扰(RNAi)作为一种高效、特异的基因表达阻断技术，已被广泛应用于肿瘤和病毒的研究。通过构建表达shRNA的重组质粒虽然在细胞水平上可以对HSV-2的ICP4、UL27等基因产生一定的沉默作用[7-8]，但尚未达到人们利用RNAi来抑制HSV-2复制的预期效果。可能的原因包括：①RNAi是通过小干扰RNA (small interference RNA ,siRNA)介导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) 选择性地降解靶mRNA，由于在细胞内RISCs与siRNA的结合具有一定的饱和性，因此不可能通过增加siRNA的方式来增加mRNA的降解程度，相反过多的siRNA还有可能抑制RISCs活性[9]；②HSV-2感染以及复制涉及到多种基因的参与，单基因的干扰可能由于基因的变异或敏感性的差异不能取得良好效果。

因此，我们设想将病毒的2个或者多个基因作为RNAi的分子靶点。根据我们前期实验中对UL54基因(数据未发表)和UL29基因[10]干扰位点的筛查，分别构建了UL54shRNA和UL29 shRNA表达质粒，采用同时干扰UL54和UL29两个基因的方式，探讨其对HSV-2复制的抑制作用。其中在mRNA水平上的单基因干扰组中UL54 shRNA对UL54基因mRNA的抑制率为69.61%，UL29 shRNA对UL29基因mRNA抑制率为66.08%， UL54 shRNA+UL29 shRNA双基因干扰组对UL54mRNA表

达的抑制率约为82.56%，UL29mRNA表达抑制率约为74.63%，显示双基因干扰在基因沉默上优于单基因干扰。通过Western blot得到的ICP27和ICP8表达数据也验证了这种双基因干扰方式的效果。此外，从子代的病毒滴度的变化和细胞的存活率等上也表明UL54 shRNA+UL29 shRNA双基因干扰组的子代病毒滴度最低，细胞的存活率也更高，说明其能更好的抑制HSV-2的复制。

HSV-2基因组表达具有时序性，基因表达之间会产生相互的影响和作用。UL29基因表达产物ICP8在病毒合成中扮演关键作用，能够控制其它基因表达并参与转录前位点和转录区的形成。立即早期基因UL54的表达产物ICP27除了参与调节HSV-2病毒和宿主细胞mRNA的合成与成熟以外，还能与其它立即早期基因表达产物一起调控早期基因和晚期基因的表达，如抑制其它立即早期基因和早期基因的表达。因此，同时干扰阻断UL54、UL29基因表达，可能会在阻断二者基因表达过程中产生相互的协调作用，能够更好地抑制病毒基因组的复制。对阻止HSV-2病毒感染宿主细胞和抑制DNA合成复制有更好的效果。本实验结果表明这种对病毒不同基因的联合干扰效果优于对单个基因的干扰效果，提示采用多基因联合干扰可能在今后的临床研究中具有潜在的价值。

[参考文献]

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