赤水丹霞来源抗白色念珠菌放线菌分离及进化分析

王 苗，李园园，邵美云，罗显涛，吴述铭，曾令荣，胡咏雄，岳昌武

(1.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州省特色微生物资源及药物开发重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

白色念珠菌是最常见的条件致病性真菌，可以引起皮肤念珠菌病、黏膜念珠菌病、内脏及中枢神经念珠菌病以及龋齿等多种疾病。近年来，随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及器官移植术的开展，白色念珠菌引起的发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果[1-4]，抗白色念珠菌药物副作用及白色念珠菌耐药问题也给白色念珠菌病的防治带来严峻的挑战[5-6]。本研究从赤水丹霞山土样中，共筛选得到7株具有抗白色念珠菌活性的放线菌，其中6株为链霉菌，1株为地中海拟无枝酸菌，可为开发放线菌来源的抗白色念珠菌的药物提供菌株来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样 土样采自赤水丹霞山区地表10 ～20 cm土层，共300份，无菌样品袋中常温保存、运输。

1.1.2 培养基 分离培养基:ISP2固体培养基(葡萄糖4g，CaCO32g，麦芽抽提物10g，酵母抽提物4g，琼脂粉15g，加去离子水定容到1L)；自来水酵母粉琼脂培养基(酵母浸汁0.25g，K2HPO40.5g，琼脂粉18g，加去离子水定容到1L)；高氏1号培养基(可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，Fe SO40.01g，琼脂20g，加去离子水定容到1L)。

发酵培养基：无钙GYM固体培养基(葡萄糖4g，酵母抽提物4g，麦芽抽提物10g，琼脂粉15g，加去离子水定容到1L)；含钙GYM固体培养基(无钙GYM+CaCO32g)；液体GYM培养基(葡萄糖4g，酵母抽提物4g，麦芽抽提物10g，1 mL微量元素预混液，加去离子水定容至1L)。以上培养基121 ℃，30 min，灭菌后备用。

1.1.3 测活菌 白色念珠菌菌株由本实验室保藏。

1.1.4 主要试剂 常规生化试剂均为分析纯，购自成都科龙化工；抗菌药物购自sigma公司；培养基成份购自碧迪生物上海公司；酚/氯仿等DNA提取试剂购自北京索莱宝公司；分子生物学试剂及酶类购自大连宝生物公司。

1000×微量元素预混液(ZnSO4·7H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，MnCl2·4H2O 2g，CuSO4·5H2O 2g，Na2B4O7·10H2O 2g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 2g 加去离子水800mL，充分搅拌使其溶解，并定容到1L，常温保存)。

抗菌药物储液：重铬酸钾50 mg/L，制霉菌素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放线菌酮50 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离 土壤样品预处理：分别称取2g样品于无菌研钵中，加入CaCO30.2g，用无菌杵研磨成细粉，装入50 mL无菌离心管中，28 ℃风干2周，加入无菌水30 mL，在28 ℃摇床充分震荡1.5 h，使其充分悬浮，55 ℃烘箱中静置25 min，促使放线菌孢子萌发[7]。

菌株分离：将土壤预混液分别梯度稀释为10-1、10-2和10-33个浓度梯度，振荡混匀后分别及时吸取200 μL土样悬浊液均匀涂布于含抗菌药物(终浓度为重铬酸钾50 μg/L，制霉菌素20μg/L，萘啶酮酸20 μg/L，放线菌酮50 μg/L)的固体分离培养基表面，28 ℃静置培养，随时观察培养基上菌落状态，挑取放线菌形态的单菌落，进一步纯化培养[8]。

1.2.2 16S rRNA基因系统发育分析 将筛选得到的活性菌株利用经典溶菌酶/SDS结合酚/氯仿法提取基因组总DNA为模板，利用细菌16S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，通用引物序列27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反应条件为：50 μL反应体系94 ℃，预变性5 min；PCR热循环程序为94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，扩增30个循环，72 ℃总延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。16S rRNA的PCR扩增产物测序由上海立菲生物公司完成。测序结果用Blast软件[9]在线比对，在NCBI数据库中用Blast程序[9]在线进行序列相似性比对搜索，从GenBank数据库中获得相似性较高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作为参比对象，采用MEGA 5.0软件进行聚类分析和构建NJ系统发育树[10-12]。

1.2.3 发酵产物抽提 用接种环挑取少许待测菌株孢子划线接种于装有100 mL 含钙GYM固体培养基的250 mL锥形瓶中，28 ℃静置培养10 d，培养物加入100 mL乙酸乙酯，150 rpm，振摇24 h充分萃取，静置30 min，取上层乙酸乙酯层于旋转蒸发仪中，38 ℃蒸干，加入1 mL甲醇重溶抽提物，用于活性测试。

1.2.4 发酵产物抗白色念珠菌活性测试 白色念珠菌接种GYM液体培养基，28 ℃摇床200 rpm培养16～18 h。取2 mL新鲜菌液与200 mL即将凝固的无钙GYM固体培养基混匀后迅速倒板，待培养基凝固后用无菌打孔器打直径为5 mm孔，分别吸取50 μL前述抽提产物于孔中，测试平板置于28 ℃过夜培养。根据抑菌圈的有无和大小判定抗菌活性及强弱。

2 结果

2.1 分离菌株16S rRNA系统进化分析 共采集300份土壤样品，从中分离得到分离菌株600株，根据形态初步排重后选取其中28株放线菌形态的菌株进行了16S rRNA系统进化分析。其中有26株属于链霉菌，2株属于地中海拟无枝酸菌(见图1)。

◆为标准菌株;▲为抗白色念珠菌。图1 28株分离菌株系统进化分析

2.2 部分赤水来源的抗白色念珠菌活性的链霉菌分离菌株菌落形态特征Streptomycessp.CSDX201，中间凸型，无横隔，不断裂，边缘较薄，有明显的光滑的肉粉色孢子，基内菌丝浅粉色，气生菌丝白色。Streptomycessp.CSDX1，中间凹型，边缘较薄，产生气生菌丝，孢子丝有横隔，孢子浅黄色，多刺。Streptomycessp.CSDX258, 扁平型，为肉粉色，在培养基上形成具高度分支的基内菌丝。Streptomycessp.CSDX26，馒头型，较厚，孢子凸起，成白色状态分布(见图2)。

2.3 分离菌株抗菌活性 将获得的发酵液乙酸乙酯萃取浓缩物对临床分离致病菌白色念珠菌进行抗菌活性筛选，共发现7株分离菌株表现抗白色念珠菌活性(见图3)，其中6株为链霉菌，占总数的22.22%，1株为地中海拟无枝酸菌，占总数的3.70%。其中Streptomycessp.CSDX258、Streptomycessp.CSDX26、Streptomycessp.CSDX201、Streptomycessp.CSDX225及Streptomycessp.CSDX097表现出很强的抗白色念珠菌活性(抑菌圈直径可达4～7cm)。Streptomycessp.CSDX1与Amycolatopsissp.CSDX220有较强的抗白色念珠菌活性(抑菌圈直径可达1.5 ～3 cm)。

A：Streptomyces sp.CSDX201;B:Streptomyces sp.CSDX1;C:Streptomyces sp.CSDX258;D：Streptomyces sp.CSDX26。图2 部分抗白色念珠菌链霉菌分离菌株菌落形态特征

A、B、C、D为抗白色念株菌测活图。A1 ：Streptomyces sp.CSDX1；A2：Streptomyces sp.CSDX26；A3：Streptomyces sp.CSDX155；B1：Streptomyces sp.CSDX201；B2：Streptomyces sp.CSDX097；B3：Streptomyces sp.CSDX253；C1： Streptomyces sp.CSDX225；C2： Streptomyces sp.CSDX155；C3：甲醇对照；D1：Streptomyces sp.CSDX258；D2：Amycolatopsis sp.CSDX220；D3： Streptomyces sp.CSDX349。图3 抗白色念珠菌抗菌活性测试

3 讨论

为了开发新型的抗白色念珠菌药物，很多研究者开始尝试从虫草、放线菌等药用微生物中开发活性化合物，如李义勇等[13]从虫草中找到多个抗白色念珠菌的活性部位，王玉梅等[14]从大连小平岛和星海湾等海域来源的海洋链霉菌中分选得到抗白色念珠菌的L131链霉菌菌株，得到了初步纯化的卤化活性物质，矫文策等[15]首次报道了大连海域来源的摩洛哥链霉菌近缘菌株抗白色念珠菌活性物质的分离纯化,这两种活性物质可能是不饱和酮酯类和不饱和苯衍生物。

我们通过选择培养基从赤水丹霞山的土壤中初步形态分离，选取其中28株菌株进行抗白色念珠菌活性测试，获得7株抗白色念珠菌活性放线菌，分子分类结果表明其中6株为链霉菌，1株为地中海拟无枝酸菌。与链霉菌标准菌株进行比对，Streptomycessp.CSDX51相似性为99%，Streptomycessp.CSDX 201，Streptomycessp.CSDX258，Streptomycessp.CSDX312，Streptomycessp.CSDX253，Streptomycessp.CSDX472，Streptomycessp.CSDX365，Streptomycessp.CSDX095，Streptomycessp.CSDX349，Streptomycessp.CSDX097，Streptomycessp.CSDX155相似性为98%。Streptomycessp.CSDX26，Streptomycessp.CSDX084，Streptomycessp.CSDX140，Streptomycessp.CSDX191，Streptomycessp.CSDX192，Streptomycessp.CSDX331，Streptomycessp.CSDX532，Streptomycessp.CSDX341，Streptomycessp.CSDX453，Streptomycessp.CSDX249，Streptomycessp.CSDX1相似性为97%，Streptomycessp.CSDX 152，Streptomycessp.CSDX 225相似性为96%。Streptomycessp.CSDX177相似性为95%，Streptomycessp.CSDX52相似性为94%，Streptomycessp.CSDX099相似性为93%。2株属于地中海拟无枝酸菌，与地中海拟无枝酸菌标准菌株进行比对，Amycolatopsissp.CSDX220相似性为84%，Amycolatopsissp.CSDX477相似性为82%(见图1)。提示这里面可能存在着较新的分类单元。

研究结果表明贵州赤水山地区的土壤样本中分离出来的链霉菌菌株，具有很好的抗白色念珠菌活性，下一步将对这些菌株进行大量发酵，获得更多的活性产物，同时把此次获得的发酵产物进行结构解析，初步确定其抗白色念珠菌机制，可为开发研究抗白色念珠菌提供一定的资源基础。

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