杞菊地黄丸中没食子酸的高效液相色谱电化学检测

索志荣等

摘 要：目的：建立测定杞菊地黄丸中没食子酸的高效液相色谱电化学分析方法，并用该方法测定杞菊地黄丸。方法：采用反相高效液相色谱电化学检测法，以Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）为色谱柱；甲醇-2%醋酸为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1；检测电压为0.7V，柱温为30℃。结果：没食子酸浓度在15.81-41.73μg·mL-1（r=0.9992）范围内线性关系良好，平均回收率（n=3）分别为98.1%（RSD=1.6%）。结论：方法快速，准确，可用于杞菊地黄丸的质量控制。

关键词：高效液相色谱；电化学检测；杞菊地黄丸；没食子酸

杞菊地黄丸（浓缩丸）由枸杞子、菊花、熟地黄、山茱萸（酒制）、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻八味药组成，具有滋肾养肝的功效，主要用于肝肾阴亏、眩晕耳鸣、羞明畏光、迎风流泪、视物昏花等症。其主要成分山茱萸中含有没食子酸[1]，且研究表明没食子酸具有良好的抗氧化性能[2]。目前，对酚酸类化合物没食子酸的分离检测方法有薄层色谱法[3]，毛细管电泳法[4]，高相液相色谱法[5]，紫外分光光度法[6]等。但对杞菊地黄丸中没食子酸的检测未见报道。文章基于电化学检测器灵敏度高、选择性好等特性[7]，采用高效液相色谱电化学检测（HPLC-ECD）法，对杞菊地黄丸中没食子酸进行了分离和测定。为评价和控制杞菊地黄丸的质量提供了依据。

1 试剂与仪器

试剂：没食子酸对照品（购自sigma公司），纯度为99.7%；甲醇为色谱纯；醋酸为分析纯；水为超纯水；杞菊地黄丸：芜湖张恒春药业有限公司（国药准字Z34020128，批号：1306131、1208091）。

仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；UPH型优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

2 溶液配制

2.1 供试品溶液

取杞菊地黄丸40丸，在研钵中研细，过6号筛后，得到杞菊地黄丸粉末样品。取杞菊地黄丸粉末2g，精确称量，置于10mL试管中，加入适量甲醇，超声提取2次，每次15min，滤入25mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，摇匀。取适量用0.45μm微孔滤膜滤过，即得杞菊地黄丸供试品溶液。

2.2 对照品溶液

精密称取没食子酸对照品5.24mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，配得没食子酸浓度为0.21mg·mL-1的对照品溶液，作为储备液，其它不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。

3 色谱条件

ZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）色谱柱（美国）；流动相：甲醇-2%醋酸，梯度洗脱，其时间程序为0→30→32→37→40→50min，甲醇体积分数相应为5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，流速：1.0mL·min-1；电化学检测器：安培检测，电压0.7V，柱温：30℃。没食子酸的保留时间为3.530min。色谱图见图1。

4 方法学考察与样品分析

4.1 线性关系考察

精密量取“2.2”项所配的没食子酸储备液一定体积于量瓶中，用甲醇稀释，配成没食子酸浓度分别为4.2，8.4，16.8，25.2，33.6，42.0μg·mL-1的对照品溶液，进样10.0μL进行测定，以平均峰面积Y（mAu·s）对浓度C（μg·mL-1）進行线性回归，没食子酸回归方程和相关系数为：Y=3353.26C-52023.86（r=0.9992）。

4.2 精密度试验

精密吸取杞菊地黄丸（批号：1306131）的供试品溶液10.0μL，重复进样6次，进行测定，原儿茶酸峰面积积分值的RSD为1.4%。

4.3 重复性试验

精密称量杞菊地黄丸（批号：1306131）粉末约2g共6份，按“2.1”项操作制备供试品溶液后，进行测定，没食子酸含量的RSD为2.9%。

4.4 稳定性试验

对杞菊地黄丸（批号：1306131）的供试品溶液在8h之内每隔1h进行考察，结果没食子酸峰面积积分值的RSD为1.8%（n=9）。

4.5 加样回收率试验

精密称量杞菊地黄丸（批号：1306131）粉末约1.0g，共3份，每份分别准确加入1.0mL没食子酸储备液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液后，进行测定。没食子酸的平均加样回收率（n=3）为98.7%；RSD为2.3%。

4.6 样品分析

按“2.1”项下操作制备供试品溶液，在“3”项的色谱条件下进样10.0μL，对其进行检测，用标准曲线法以峰面积计算含量。结果批号1306131和1208091中没食子酸含量分别为0.268mg·g-1和0.273mg·g-1。

5 讨论

5.1 提取条件的选择

分别考察了水，20%甲醇，40%甲醇，60%甲醇，80%甲醇及甲醇对提取效率的影响。结果显示：用甲醇作为溶剂提取时，没食子酸的提取率最高。

5.2 工作电压的选择

以对照品储备液配制一定浓度的没食子酸待测液，在“3”项条件下，进样7.0μL，考察检测电位范围为：0.1-0.9V。以没食子酸在ECD上的响应峰面积对电极的工作电压作图，得到其流体动力学伏安图，如图2。由图可以看出：当电位高于0.7V时，没食子酸的电化学响应出现一个平台，继续提高电位，虽然峰电流继续增加，但噪音也明显增加。故选择检测电位为0.7V（vs.Ag/AgCl）。

5.3 色谱条件的优化

先后尝试了不同比例的甲醇-醋酸作为流动相的等度洗脱以及各种梯度洗脱，对色谱条件进行了优化。结果表明：不加醋酸或醋酸浓度较低时，色谱峰出现不同程度的拖尾，加入醋酸后随着浓度的增加色谱峰的对称性增加，且保留时间变化不大，同时考虑到色谱柱的耐酸范围，故选0.2%醋酸溶液作为一相洗脱液；为得到较好的分离效果，采用梯度洗脱方式。经试验，色谱条件为：流动相为甲醇-2%醋酸，梯度洗脱，时间程序为0→30→32→37→40→50min，甲醇体积分数相应为5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，色谱分离效果较好。

参考文献

[1]李秀芬，姜元甲，南劲松，等.HPLC法测定祀菊地黄丸中马钱普的含量[J].药物分析杂志，2008，28（5）：785-787.

[2]谢晓艳，刘洪涛，张吉，等.没食子酸体外抗氧化作用研究[J].重庆医科大学学报，2011，36（3）：319-322.

[3]王克英.石榴皮中没食子酸定性定量方法研究[J].中国中药杂志，2005，30（15）：1171-1172.

[4]翟海云，杨冰仪，黄庆华，等.毛细管电泳法快速测定五倍子中的没食子酸[J].分析试验室，2007，26（11）：35-37.

[5]索志荣，曹炜，秦海燕，等.葡萄酒中4种酚酸类化合物的色谱电化学分析[J].食品科学，2005，26（10）：191-193.

[6]邓秀霞，李琴，王留留.山茱萸果核中没食子酸的提取及检测方法[J].农业机械，2011（32）：137-140.

[7]索志荣，秦海燕，曹炜，等.复方丹参片中四种成分的高效液相色谱-电化学检测-紫外检测法分析[J].色谱，2005，23（6）：626-629.

作者简介：索志荣，副教授，从事药物分析研究。