兔动脉粥样硬化血管成形术后再狭窄模型的建立与改良*

曾智桓， 赵艳群， 周万兴， 黄瑞邈， 朱桂平， 肖月琼

(广东药学院附属第一医院心内科，广东 广州 510080)

经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)最有效的手段之一，但术后3～6个月内原扩张部位再狭窄率高达30%～50%，明显限制了经皮冠状动脉腔内成形术的临床疗效[1]。进一步研究再狭窄的发病机制，有效防治经皮冠状动脉介入术后再狭窄显得极为重要。所以首先要建立理想的、合乎临床多因素致病机制的血管再狭窄动物模型。本研究通过下肢动脉穿刺与球囊损伤、球囊血管成形术结合，成功建立兔动脉粥样硬化血管成形术后再狭窄模型，方法简单，成功率高，可重复性强，为临床研究和治疗提供了可靠的疾病模型。

材 料 和 方 法

1 动物

雄性新西兰大白兔30只，体质量(1.86±0.65) kg，由广东省中医药大学实验动物中心提供(动物合格证号为0064167)。按随机数字表法分为3组，即对照组、下肢动脉穿刺组及下肢动脉切开组。实验在中山大学实验动物中心及广东药学院附属第一医院导管室完成。

2 主要仪器及设备

TERUMO 桡动脉穿刺包(包括穿刺套管针、细超滑钢丝和6F桡动脉鞘)为日本泰尔茂株式会社生产；碘海醇注射液(欧乃派克350注射液)为通用电气药业上海有限公司生产；经皮冠状动脉腔内成形术球囊FireStar 3.0 mm×20 mm为美国强生公司生产；HITACHI 7180全自动生化分析仪；V5000数字减影X射线机(Philips)；CREALIFE ST-CRS思创科技图像工作站。

3 模型制备方法

3组家兔均用高脂饲料喂养1周，除对照组外，其它2组家兔均采用氯胺酮(25 mg/kg)+地西泮(0.11 mg/kg)腿部肌肉注射麻醉，仰卧位固定，下肢备皮。下肢动脉穿刺组采用TERUMO桡动脉穿刺包穿透法穿刺股动脉成功后轻柔地进入导丝，沿导引钢丝插入6F桡动脉鞘管，300 U肝素抗凝，在数字减影X射线机下，经动脉鞘管注入碘海醇注射液行动脉造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 经皮冠状动脉腔内成形术球囊至髂动脉，用303.975 kPa充盈球囊，在髂动脉上下牵拉3次，充分剥离髂动脉内皮。伤口纱布卷加压包扎。下肢动脉切开组，在右大腿中部沿股动脉走行切开皮肤，分离皮下组织及右侧股动脉，结扎动脉远端，阻断动脉近端，纵行切开动脉壁，插入TERUMO桡动脉鞘，300 U 肝素抗凝，经动脉鞘管注入碘海醇注射液行动脉造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm经皮冠状动脉腔内成形术球囊至髂动脉，用303.975 kPa充盈球囊，在髂动脉上下牵拉3次，充分剥离髂动脉内皮。拔出鞘管，结扎动脉近端。缝合伤口皮肤，无菌敷料覆盖。2组均肌肉注射青霉素钠(8.0×105U/d)×3 d。3组动物继续高脂饲养4周。

高脂饲养4周后，下肢动脉穿刺组及下肢动脉切开组的家兔再次采用上述方法麻醉、固定。下肢动脉穿刺组下肢备皮，采用TERUMO桡动脉穿刺包穿透法穿刺股动脉成功后轻柔地进入导丝，沿导引钢丝插入6F桡动脉鞘管，300 U肝素抗凝，在数字减影X射线机下，经动脉鞘管注入碘海醇注射液行动脉造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 经皮冠状动脉腔内成形术球囊至髂动脉损伤处，用607.95 kPa充盈球囊扩张髂动脉损伤处，每次扩张30 s，扩张3次。下肢动脉切开组右颈动脉区域备皮，沿颈动脉走行切开皮肤，分离皮下组织及右侧颈动脉，结扎动脉远端，阻断动脉近端，纵行切开动脉壁，插入TERUMO桡动脉鞘，300 U 肝素抗凝，经动脉鞘管注入碘海醇注射液行动脉造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 经皮冠状动脉腔内成形术球囊至右髂动脉，用607.95 kPa充盈球囊扩张髂动脉损伤处，每次扩张30 s，扩张3次。3组动物均改为普通饲料喂养4周。最后再采用上述方法麻醉、固定及穿刺股动脉造影，采动脉血检测血脂，取髂动脉。

4 观察指标及方法

各组血清标本均采用HITACHI 7180全自动生化分析仪测定血清低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇和三酰甘油浓度。髂动脉标本取材后立即用体积分数4%甲醛溶液固定1 d后脱水，石蜡包埋，连续病理切片2张(厚4.0～5.0 μm)，行苏木精-伊红和免疫组化染色。各组造影结果采用CREALIFE ST-CRS思创科技图像工作站进行血管狭窄分析。

5 统计学处理

采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计分析，各组计量资料数据用均数±标准差(mean±SD)表示。实验数据先行正态性检验和方差齐性检验；两组均数比较用t检验;两组以上均数比较在方差齐时用单因素方差分析，方差不齐时用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动物一般情况

下肢动脉切开组1只实验兔第2次实验术后1周因感染、腹泻死亡，对照组及动脉穿刺组均顺利完成实验进入结果分析，成功率100%。所有实验兔均未见肢体缺血坏死，但下肢动脉切开组右下肢动脉结扎术后行动明显迟缓，进食量下降，精神状态差。

2 3组家兔的血脂水平比较

血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇在动脉切开组均较动脉穿刺组及模型对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)，三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇在3组间无显著差别(P>0.05)。

表1 血清三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇的检测结果

3 病理学检测结果

对照组可见粥样斑块，动脉壁及内膜略增厚，中膜平滑肌少量泡沫细胞及炎性细胞形成(图1A)；动脉穿刺组(图1B)及动脉切开组(图1C)均可见明显粥样斑块，动脉壁增厚，管腔狭窄，层次不清，内膜增厚，中膜平滑肌增生紊乱，可见大量炎性细胞浸润，形成典型的“纤维帽”结构，尤其是动脉穿刺组，部分斑块内出现钙化或大量纤维化。

Figure 1. Iliac artery in the rabbits with different treatments (hematoxylin-eosin staining, ×100).A:control group; B:arterial puncture group; C:limb artery incision group.

4 血管造影血管狭窄分析

与对照组相比，动脉穿刺组与动脉切开组均形成显著血管再狭窄，见图2。与对照组相比，动脉穿刺组与动脉切开组血管面积狭窄率及直径狭窄率均有显著差异(P<0.01)；动脉穿刺组面积狭窄率及直径狭窄率均较动脉切开组稍高，但尚未达统计学差异，可能与样本量较小有关,见表2。

Figure 2. Iliac artery stenosis in the rabbits with different treatments (angiography, ×3).A:control group; B: arterial puncture group; C:limb artery incision group.

表2 对照组、动脉穿刺组和动脉切开组家兔髂动脉再狭窄的比较

讨 论

如何建立有效的血管再狭窄模型对开展血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty)的研究非常重要[2]。国内外用于血管再狭窄研究的动物模型的建立方法众多，主要选择的动物有大鼠、兔、猪、犬等，选取的手术部位也多种多样[3]。新西兰兔建模稳定，成本较低，为最常用的实验动物[4]。兔的髂动脉管腔大小更接近人的冠状动脉再狭窄, 故本实验选用该动脉。

兔血管再狭窄模型建模方法多采用切开、结扎股动脉或颈动脉，球囊损伤加高脂喂养，在此基础上行球囊扩张建立再狭窄模型，由于切开、动脉结扎的技术问题，以及时常造成伤口感染，动物肢体缺血，活动能力差，进食少，经常发生实验动物死亡情况[5]。本实验切开组出现1只动物死亡，进食量明显下降，最后化验血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇较对照组低，也证实了这一点。而采用经皮动脉穿刺，术后局部加压包扎止血即可，无明显手术伤口，有利于实验动物术后的恢复。

传统的兔动脉粥样硬化及再狭窄模型均采用切开后结扎方法，动脉结扎后形成盲端，血流显著减慢，部分可能无血流，与临床所见再狭窄形成过程中血流动力学不一致，造成血管内膜增生和血管向内重塑反应不同，可导致实验结果偏差[6]。

目前尚没有关于经皮穿刺兔血管制作血管再狭窄模型的研究报道。本实验通过多次穿刺兔股动脉，对兔髂动脉进行球囊损伤，建立兔血管狭窄的病理模型，再对病变血管进行球囊扩张成形术，形成再狭窄模型，可对血管再狭窄疾病发生发展的过程进行动态观察和评价。但经皮穿刺兔股动脉要求术者要有良好的血管穿刺基础，在日常工作中如果能熟练地进行桡动脉穿刺者，穿刺成功率将大大提高。建议使用套管针穿刺，尽可能一次穿刺成功，否则局部血肿将严重影响再次穿刺。一旦发生，可局部压迫止血，选择对侧股动脉穿刺。本实验充分证实了多次兔股动脉经皮穿刺的可行性，无需反复结扎动脉，为兔血管成形术后再狭窄提供了新的研究方法。

本文为动物实验，动脉粥样硬化形成迅速，与人类的冠状动脉血管成形术后再狭窄仍存在一定的差异。但由于本实验方法有模型稳定可靠、易于复制、成功率高等优点，而且证实了在血管再狭窄机制方面均存在血管内膜增生、平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润、斑块内部钙化或大量纤维化等机制，与临床再狭窄相似，是血管成形术后再狭窄研究中较理想的动物模型，值得进一步研究。

[参 考 文 献]

[1] Togni M,Windecker S,Cocchia R,et al.Sirolimus-eluting stents associated with paradoxic coronary vasoconstriction[J].J Am Coll Cardiol, 2005, 46(2):231-236.

[2] Suzuki Y, Yeung AC, Ikeno F.The pre-clinical animal model in the translational research of interventional car-diology[J].JACC Cardiovasc Interv, 2009, 2(5):373-383.

[3] Touchard AG, Schwartz RS.Preclinical restenosis models: challenges and successes[J]. Toxicol Pathol, 2006, 34(1):11-18.

[4] Langeveld B, Van Gilst WH, Zijlstra F. A simple, inexpensive, rapid, and accurate preclinical model for in-stent restenosis[J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 45(8):1310-1311.

[5] Knopfholz J, Précoma DB, Brofman PR,et al.The effect of L-arginine on neointimal proliferation and artery remo-deling on an iliac artery lesion caused by a balloon catheter in hypercholesterolemic rabbits[J]. Arq Bras Cardiol, 2006, 87(4):520-524.

[6] Paszkowiak JJ, Maloney SP, Kudo FA,et al.Evidence supporting changes in Nogo-B levels as a marker of neoin-timal expansion but not adaptive arterial remodeling[J]. Vascul Pharmacol, 2007, 46(4):293-301.