含硼替佐米方案对多发性骨髓瘤患者出凝血功能及循环中微颗粒水平的影响*

刁翔文， 李 娟， 刘俊茹， 黄蓓晖， 李 滢

(中山大学附属第一医院血液科，广东 广州 510080)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性克隆性浆细胞疾病，常合并有出凝血功能异常，容易并发出血或动、静脉血栓[1]。MM出凝血异常与多种因素相关，如M蛋白水平、基因、内皮细胞损伤、凝血因子VIII(factor VIII，FVIII)和血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)升高、纤溶异常和化疗药物等[2]。

MM治疗目前有许多新药，例如硼替佐米、沙利度胺、来那度胺等。其中免疫调节剂沙利度胺或来那度胺通过增强组织因子和血管内皮生长因子的表达、下调凝血酶敏感蛋白、诱导细胞因子介导的活化蛋白C抵抗等机制影响MM的出凝血功能，促进血栓形成[3]。蛋白酶体抑制剂硼替佐米对MM出凝血系统的作用目前尚不清楚，但多项临床研究显示采用硼替佐米联合其它化疗药物治疗的MM患者，血栓发生率小于5%[4]。

微颗粒(microparticles，MPs)是一类细胞受刺激后形成的膜性小囊泡，有促凝、促炎症、促使血管生成、调节内皮功能等作用[5]。最近对于血栓性疾病的研究发现，循环中的MPs是出凝血系统的重要组成；同时MPs还是细胞-细胞间交流的重要调节者，是疾病和出凝血系统之间沟通的重要桥梁[5]。多种疾病如急性冠脉综合征、肿瘤、糖尿病、系统性硬化[6-7]等已观察到MPs水平升高与活性增加，但在多发性骨髓瘤患者中目前仍缺乏相关研究。

本研究使用流式细胞术检测38例采用硼替佐米联合脂质体阿霉素、地塞米松(bortezomib+adriamycin+dexamethasone,PAD)诱导的MM患者微颗粒基础水平及动态变化，同时全面检测出凝血系统各项指标，旨在了解硼替佐米对MM患者出凝血功能和MPs水平的影响及意义。

材 料 和 方 法

1 研究对象

收录我院2012年10月至2013年10月收治的38例初诊为MM、接受PAD方案诱导化疗的病人，分别在治疗前和PAD方案诱导治疗后第1、2、3疗程采集外周血样本。同时留取30例无高血压病、高脂血症、糖尿病、自身免疫性疾病等病史且半月内未使用任何抗凝药物的健康成年人外周血样本作为对照组。

2 主要试剂及仪器

单克隆荧光抗体annexin V-FITC和流式细胞仪校准微球(1.0 μmol/L)均为Becton Dickinson产品；直径10 μmol/L的Flow-Count荧光微球(992个/μL)为Beckman-Coulter产品；流式细胞仪Moflo为Beckman-Coulter产品。

3 方法

3.1常规凝血指标检测 Sysmex公司CA-7000全自动血凝分析仪测定血清凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen, Fbg)、D-二聚体(D-dimer,D-D)、凝血酶时间(thrombin time,TT)、FVIII、蛋白C(protein C)、蛋白S(protein S)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)和纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor, PAI)；Chrono-Log CA560型血小板聚集仪进行血小板聚集功能检测。

3.2MPs的检测方法 抽取患者清晨空腹静脉血2.4 mL，用0.105 mol/L柠檬酸钠抗凝，4 ℃、1 500×g、15 min离心后吸上层血浆至EP管，再4 ℃、1 900×g、15 min离心后取300 μL贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，保存在-80 ℃冰箱。上流式机前PPP在冰水混合物解冻，取40 μL PPP与5 μL annexin V- FITC、10×annexin V binding buffer 355 μL充分混合，避光孵育20 min 后加入10 μL Flow-Count荧光微球，混匀后上流式细胞仪检测。选用鼠抗人IgG-FITC抗体作同型对照。用1.0 μm的标准微球设定前向检测区，所有MPs均以直径范围在0～1.0 μm为界定范围，并以annexin V标记总MP(total MPs，TMPs)。数5 000个荧光微球计数停止，同时记录流式细胞术检测到的某抗体阳性个数，按下列公式计算：某抗体阳性MPs的绝对数(/μL)= 荧光微球密度(992/μL)×某抗体阳性个数流式细胞术检测值/血浆稀释倍数(4)×荧光微球个数流式细胞术检测值(5 000)，见图1。

Figure 1. Flow cytometric analysis and quantification of MPs.A: determination of forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) characteristics of light by 1.0 μm standard beads in buffer to establish the R1 or MP gate. The R2 includes 10 μm Flow-Count beads used for enumerating MPs; B: detection of phosphatidylserine po-sitive MPs by annexin V-FITC labeling on the y-axis in relation to SSC on the x-axis.

4 统计学处理

符合正态分布数据用均数±标准差(mean±SD)表示，并采用t检验或方差分析；不符合正态分布数据用中位数(四分位数间距)表示，并采用Mann-WhitneyU检验；率的比较用2检验；观察指标间的相关性用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。用SPSS 17.0软件分析。

结 果

1 研究组和对照组的临床资料

38例多发性骨髓瘤病人，中位年龄53.5岁(范围35～66岁)，男性22例(57.9%)，女性16例(42.1%)，患者治疗前一般情况见表1。治疗前9例合并出血症状，表现为鼻出血、牙龈出血，无患者出现血栓形成。2例患者在治疗过程中发生血栓形成，均为经外周中心静脉置管术后3 d内出现置管侧的上臂静脉血栓。截至本研究结束时38例患者中位疗程数为4(2～6疗程)。健康对照组30例，均为同时期志愿者，中位年龄51.5岁(范围30～61岁)，男性17例(56.7%)，女性13例(43.3%)，与MM患者相比年龄、性别差异均无显著(P>0.05)。

2 MM患者的出凝血异常

2.1MM患者出凝血指标和TMPs的基础水平 38例新诊断MM患者血小板绝对值水平为[188.00(120.00)×109/L]，小于100×109/L有5例；血小板聚集功能明显受抑制[ADP诱导血小板聚集试验结果为(63.76±21.36)%]。凝血、抗凝系统方面，FVIII:C和vWF:Rco明显高于正常值范围，分别为(152.89±31.14)%和(165.69±38.43)%，并且两者呈正相关(r=0.773，P<0.01)。纤溶方面，PAI水平升高[3.98(1.63)U/mL]。健康对照组TMPs水平为(134.29±63.09)/μL，而研究组中38例MM患者TMPs基础水平明显较对照组升高[(640.65±214.22)/μL，P<0.01]，见表2。

表1 多发性骨髓瘤患者的临床特点

表2 PAD治疗前后MM患者出凝血指标和TMPs水平

2.2MM患者出凝血指标与出血症状、骨髓瘤相关指标、疗效的关系 38例MM患者治疗前合并出血的有9例，其中6例为IgG型，3例为IgA型。在26例IgG型患者中M蛋白大于70 g/L的有9例，5例有出血症状，与小于70 g/L组相比差异显著(P<0.05)。此外，有出血症状患者较无出血症状者TT时间延长[21.94(2.20)svs19.13(3.75)s，P<0.05]，血小板聚集功能更低[(58.41±11.28)%vs(68.70±23.74)%，P<0.05]。

MM患者血小板聚集功能与M蛋白呈负相关关系(r=-0.63，P<0.05)。FVIII:C、PAI与β2-MG呈正相关(r=0.763，P<0.01；r=0.618，P<0.05)，其中11例ISS分期III期患者FVIII:C[(184.73±29.57)%]要高于II期[(141.45±33.18)%，P<0.01]和I期患者水平[(135.23±31.87)%，P=0.01]。

截至本研究结束时，共35例患者完成3疗程PAD治疗。本研究对3疗程后的疗效进行评价，并将病人分为有效组(疗效为部分缓解和部分缓解以上)和无效组(部分缓解以下)。8例无效组患者FVIII:C和vWF:Rco水平高于27例有效组患者[(180.81±25.22)%vs(147.95±38.51)%，P<0.01；(173.32±20.74)%vs(161.31± 33.70)%，P<0.05]。

2.3MM患者TMPs与出血症状、骨髓瘤相关指标、疗效的关系 9例起病时伴出血症状的MM患者，TMPs基础水平偏低[(550.63±250.26)/μLvs(710.71±181.35)/μL，P<0.05]。MM患者TMPs基础水平与β2-MG正相关(r=0.672，P<0.01)。ISS分期II期和III期共28例，该群患者TMPs 明显高于10例ISS分期I期的患者[(755.72±185.41)/μLvs(598.23±206.15)/μL，P<0.05]。3疗程PAD后疗效为PR或PR以上患者的TMPs基础水平低于PR以下患者[(606.81±193.29)/μLvs(689.54±217.22)/μL，P<0.05]，见表3。

表3 MM患者不同指标分组TMPs的水平比较

3 MM患者PAD治疗后出凝血指标和TMPs的动态变化

1疗程PAD治疗后，MM患者血小板聚集功能有所恢复[(69.40±22.87)%，P<0.05]，vWF:Rco下降[(149.59±43.25)%，P<0.05]，PAI水平也从3.98(1.63)U/mL下降至2.60(1.36)U/mL(P<0.01)；2疗程PAD治疗后血小板聚集功能平均水平恢复至正常范围内[(81.83±12.58)%，P<0.01]，PAI水平则进一步下降[1.92(1.40)U/mL，P<0.05]；3疗程PAD治疗后，PAI降至最低[0.88(1.38)U/mL,P<0.01]，血小板聚集功能和vWF:Rco则分别为(77.83±15.62)%和(151.08±41.95) %，见图2A～C，同时D-D水平下降至198.0(208.3)μg/L，与治疗前相比明显下降(P<0.05)。FVIII:C各疗程PAD治疗后的平均水平与治疗前相比差异无统计学意义，见表2。1疗程PAD治疗后，MM患者血小板绝对值升高，APTT、PT和TT缩短，AT-Ⅲ活性增强，但均在正常参考值范围内。

PAD治疗后MM患者TMPs水平显著下降，1疗程PAD后TMPs下降42.57%[(378.59±163.42)/μL，P<0.01]，2疗程后为33.62%，3疗程后下降23.53%[(184.25±93.35)/μL]，仍高于健康对照组(P<0.05),见图2D。3疗程PAD治疗后有效组的患者较无效组的患者TMPs水平更低[(174.58±103.62)/μLvs(212.38±78.84)/μL，P<0.05]，见图2E。根据3疗程PAD后M蛋白下降是否超过90%将MM患者分为2组，M蛋白下降超过90%患者TMPs下降幅度[(412.26±194.15)/μL]比小于90%的患者[(294.30±113.07)/μL]更大(P<0.01)，见图2F。在26例IgG型患者中，3疗程后IgG下降值与TMPs下降值呈正相关(r=0.496，P=0.01)，见图3。

讨 论

FVIII:C是内源性凝血系统酶性复合物的辅因子；vWF是一种异源性血浆多聚体糖蛋白，介导致栓表面与血小板的黏附并引起血小板聚集反应，小多聚体vWF是FVIII:C的载体蛋白。两者水平升高是静脉血栓形成，特别是反复静脉血栓的高危因素之一[8]。本研究显示治疗前MM患者FVIII和vWF均升高，FVIII与ISS分期相关，均与文献相符[9]。经PAD方案治疗后vWF水平降低，FVIII变化差异无统计学意义，提示PAD对FVIII和vWF活性无促进作用。

恶性浆细胞通过浸润骨髓或分泌M蛋白等方式影响血小板的生成和功能。而硼替佐米也有抑制血小板从巨核细胞释放和抑制血小板聚集等作用[3]。本研究证实M蛋白与血小板聚集功能呈负相关关系；PAD治疗后，血小板绝对值升高，聚集功能恢复，提示PAD方案通过使疾病缓解恢复血小板的正常功能。

Figure 2. Changes of some coagulation parameters and TMPs in MM patients before and after treatments.Mean±SD.n=30 (control);n=38 (MM patients).A～D: PLT aggregation/vWF:Rco/PAI/TMPs of MM patients at different time points. The box and whisker plots are showed, in which the data in box represent the 25%～75% range with the median showed as line. The minimum and maximum levels are given as high/low bars. E: after 3 cycles of PAD, TMPs level between different response groups. F: after 3 cycles of PAD, TMPs decreased more in the patients with M protein decreasing over 90%.

Figure 3. The relationship between IgG decreased values and TMPs decreased values after 3 cycles of PAD in IgG-type MM patients.

PAI为血浆中tPA的快速抑制物，在纤维蛋白溶解的调控中起关键作用。研究显示NF-κB信号系统对PAI的表达有促进作用[10]。Yagci等[11]发现多发性骨髓瘤病人纤溶活性较正常人降低，这种低纤溶状态主要与PAI活性增强相关。本研究显示MM患者PAI水平升高，ISS分期II、III期患者升高更明显；经PAD治疗后，PAI水平下降，D-D水平也降低，提示PAD方案对骨髓瘤原有的纤溶异常有缓解作用。

微颗粒是从各种不同细胞膜上脱落下来的一类膜性小囊泡，当细胞受到各种物理或化学刺激，或者细胞发生凋亡时，正常的细胞膜磷脂平衡遭受破坏，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻从而以“出芽”的形式释放出来[5]。在病理情况下，如炎症、肿瘤、自身免疫疾病和易栓状态等，补体复合物、肿瘤坏死因子α、IL-1β等活性因子触发细胞被激活或发生凋亡，细胞向血浆中释放质膜片段，导致MPs显著升高。MPs具有多种不同作用，不同来源的MPs作用也不尽相同，但促凝活性是所有MPs共有的。MPs的促凝活性主要表现在两个方面，一是其表面携带激活外源性凝血途径的组织因子，二是提供阴离子磷脂表面(如PS)供阳性凝血因子复合体的组装和凝血瀑布的激活[6]。Bucciarelli等[12]用流式细胞术研究了186例静脉血栓形成(venous thromboembolism,VTE)病人的MPs水平，发现随着MPs水平的升高，VTE的风险也逐渐升高；MPs水平在健康对照人群水平95%以上的患者发生VTE的相对危险度是小于95%的患者的2.2倍。而微颗粒的严重减少可导致出血表现，如Scott综合征[13]。本研究数据显示初诊MM患者TMPs比健康对照组升高，同时TMPs水平与β2-MG呈正相关，提示TMPs除反映出凝血异常外，可能还与骨髓瘤肿瘤负荷和疾病严重程度相关。PAD治疗后TMPs明显下降，3疗程后TMPs下降水平与M蛋白下降程度相关，提示PAD使疾病缓解同时降低TMPs水平。

综上所述，多发性骨髓瘤疾病本身存在凝血因子活化、低纤溶和微颗粒水平升高等促凝异常，PAD方案使疾病缓解同时恢复血小板功能、纠正纤溶异常，降低MPs水平。以上因素可能是MM患者采用含硼替佐米方案治疗时血栓发生率低的部分原因。

[参 考 文 献]

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