MdmX在Axin－p53信号通路中的调控机制

贺 颖，叶志云

（厦门大学生命科学学院，福建 厦门361102）

鼠双微体基因X（MdmX，亦称 Mdm4）是1996年发现的一个新的p53结合蛋白［1］，由于它与另一个p53结合蛋白鼠双微体基因2（Mdm2）在结构上高度相似，因而被命名为MdmX.它与Mdm2在结构上同源，分别由490和491个氨基酸组成［2］.2个蛋白都具有相似的功能区：N端p53结合区，介导对p53的转录调控，该区结构在2种蛋白中严格保守［3］；中央区锌指结构，由第301～329个氨基酸构成，其功能均未知［4］；C端RING结构区，该区是这2个蛋白形成同源或异源二聚体的关键，也是Mdm2作为泛素连接酶的核心，但MdmX的RING结构域却不具备泛素连接酶功能［5］.MdmX和Mdm2的蛋白结构主要差异部分在中央酸性区［4］；另外，Mdm2具有核定位信号（NLS）及出核信号（NES），而MdmX则没有［2］.在生物学功能上，MdmX和Mdm2均为p53信号通路中重要的调控因子，两者的功能各不相同，无法互相替代.敲除 Mdm2的小鼠胚胎因激活p53依赖的细胞凋亡通路而死亡，敲除MdmX的小鼠胚胎则因依赖p53的细胞增殖抑制而死亡，但若同时敲除p53基因，胚胎均能正常发育［6－9］.Mdm2和 MdmX 在p53信号通路中的调控关系非常复杂，Mdm2可以介导自身及MdmX的泛素化降解［10］，而MdmX与Mdm2的结合又可稳定Mdm2，抑制其降解［11］.两者在p53通路中的调节与它们之间的表达水平密切相关，当MdmX与Mdm2在细胞内水平相当时，它们共同抑制p53的活性；而当MdmX表达量较高时，则可稳定p53的表达［12］.

体轴发育抑制因子Axin是一个重要的架构蛋白，参与Wnt、JNK、TGF－β及p53等多种信号转导途径的调控［13－17］.在p53信号通路中，Axin与p53、HIPK2及Daxx等相互作用形成复合物，诱导p53的转录活化，共同促进细胞的凋亡［18－19］.我们曾报道过 Mdm2在 Axinp53通路中不依赖于其泛素连接酶的抑制功能［20］.Mdm2可通过竞争结合p53与HIPK2破坏Axin／p53／HIPK2活化复合体的形成，从而抑制p53的转录激活及其诱导的细胞凋亡［20］.然而，MdmX是否参与Axin－p53信号通路的调控，其作用机制等仍未知.基于MdmX与Mdm2在结构上的相似性及其在p53信号通路的重要作用，本文对MdmX在Axin－p53信号通路中的作用进行了研究.研究表明：与Mdm2相似，MdmX也能通过竞争Axin与p53的结合，从而抑制Axin对p53的转录激活.这一发现有助于全面了解MdmX的细胞生物学功能，丰富了Axin－p53信号通路的调控机理，并可为肿瘤的临床治疗提供新的线索.

1 材料与方法

1.1 材 料

使用的大部分药品与试剂分别购自美国Sigma公司、上海生工（Sangon）生物工程公司和华美（Sino－America）生物工程公司；限制性内切酶和DNA标准分子质量Marker购自大连宝生（Takara）生物工程公司；碱性磷酸酶（CIP）购自美国Promega公司；Klenow DNA聚合酶、T4DNA 连接酶（T4Ligase）、T4多核苷酸激酶（T4PNK）购自美国Invitrogen公司；用于免疫共沉淀和Western blotting分析的抗HA和DO－1抗体购自美国Santa Cruze公司；抗Axin和GFP的多克隆抗体由本实验室自行免疫新西兰兔后纯化获得；PVDF膜购自Millipore公司.

1.2 表达质粒的构建

常用的表达载体如pBluescriptⅡSK及pCMV5等由本实验室保存；Axin和p53全长表达质粒的构建参照文献［14，16］；p53－luc荧光素酶报告基因质粒的构建参照文献［16］；pEGFP－N1质粒购自Clontech公司；MdmX全长表达质粒的构建根据美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸数据库中编号为NM＿002393的MdmX mRNA 序 列 设 计 引 物 （5′－ATG ACA TCA TTT TCC ACC TCT－3′和5′－TTA TGC TAT AAA AAC CTT AAT－3′），以 HEK 293细胞的总 RNA 逆转录形成的cDNA为模板进行PCR，把MdmX全长PCR产物平端克隆到pBluescriptⅡSK中.测序验证后，用BamH I和XhoI亚克隆到表达载体pCMV5－HA 中，得到 pCMV5－HA－MdmX；MdmXΔp53则是以pCMV5－HA－MdmX为模板，通过点突变PCR的方法获得，所用引物序列为：5′－GAC ATC ATT TTC CAC CCT TAG CAC TTT AGC C－3′和 5′－GGC TAA AGT GAC AAG GGT GGA AAA TGA TGT C－3′.

1.3 细胞的培养与传代

所用的人胚胎肾细胞HEK 293与293T用含有10%（质量分数）小牛血清（FBS）、100IU青霉素和100μg／mL链霉素的DMEM培养基（GIBCO公司）进行培养，培养条件为37℃，5%（体积分数）CO2.细胞传代时，先将培养液吸去，用PBS缓冲液润洗一次，再加入适量含0.25%（质量分数）胰酶的0.02%（质量分数）EDTA溶液，使其覆盖细胞层，待细胞从培养瓶壁上脱落后，加入少量培养液终止胰酶的作用，再用移液管吹打数次使细胞彼此分开，加入适量的培养液将细胞吹打混匀后便可传代培养.

1.4 磷酸钙转染法

转染前24h消化细胞，离心去除胰酶消化液，加入适量的培养液，重悬浮细胞并均匀地平铺在60mm培养皿中，保持细胞密度约为40%～60%.转染前1h更换细胞培养液，小心加入约5mL预热的新鲜培养液，以免使贴壁好的细胞悬浮起来.磷酸钙－DNA沉淀的制备：在1.5mL离心管中加入220μL水，在水中央位置加入混匀好的DNA质粒.将31μL 2mol／L CaCl2小心加入到Eppendorff管底，再沿Eppendorff管壁逐滴加入2×HEPES缓冲液（1.6g NaCl、0.074 g KCl、0.027g Na2HPO4·2H2O、0.2g葡萄糖和1g HEPES依次溶解于90mL双蒸水中，用0.5mol／L NaOH将pH值调为7.05左右，加双蒸水定容至100 mL），在CaCl2与上层溶液形成的界面之间用移液枪吹出几个气泡以搅乱其界面，室温放置20～30min，使磷酸钙－DNA沉淀缓慢形成.用移液枪吹吸一次混匀后逐滴将磷酸钙－DNA沉淀加入细胞培养液中，轻微晃动使磷酸钙－DNA沉淀在细胞上分布均匀.

1.5 免疫共沉淀实验

转染后24～40h可收获细胞.将60mm细胞培养皿中的培养液吸去，加入500μL裂解缓冲液（20 mmol／L Tris－HCl（pH 7.4），150mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1mmol／L EGTA，1%（质量分数）Triton，2.5mmol／L 焦磷酸钠，1mmol／Lβ－巯基乙醇，1mmol／L钒酸钠，1μg／mL亮抑酶肽，1mmol／L蛋白酶抑制剂（PMSF），置于4℃裂解5min，用细胞刮将细胞从盘面刮下，收集在1.5mL Eppendorff管中.随后在冰上用超声处理10次，每次1s.超声处理后的细胞裂解液在4℃用13 200r／min离心30min.取50μL上清转移到新管，加入等量2×SDS样品缓冲液作为全细胞裂解液，置沸水煮10min，后放于－80℃备用.剩余上清用于免疫共沉淀分析.取5 μL蛋白A／G琼脂糖珠（Santa Cruz Biotech公司），用适量裂解缓冲液洗3次，每次3 000r／min离心3 min；洗完后，取5μL相应抗体与琼脂糖珠及400μL细胞裂解液上清和400μL裂解缓冲液混合，在4℃层析柜中缓慢颠倒混合3h，使蛋白从细胞裂解液中被特异性抗体免疫沉淀下来.免疫沉淀反应完成后，在4℃以3 000r／min速度离心3min，小心吸去上清，用500μL裂解缓冲液温和清洗琼脂糖珠3次，最后用30 μL裂解缓冲液重悬琼脂糖珠，再加入等量的2×SDS样品缓冲液，沸水煮10min，存于－80℃备用.

1.6 荧光素酶报告基因实验

铺适当密度的细胞于6孔或12孔细胞培养板中，待细胞贴壁生长到培养板孔面积的90%后，转染0.5μg荧光素酶报告基因、适量的质粒DNA，以及0.2μg pEGFP－N1.转染24h后，吸净培养液，向每孔加入200μL 细胞裂解液（0.05mol／L Tris（pH 7.8），1 mmol／L DTT，0.1% （质量分数）Triton－X100），使其覆盖细胞层，放入4℃充分裂解细胞10min.取50μL细胞悬液，与100μL荧光素／ATP混合溶液（ATP溶液：0.125mol／L Tris，25mmol／L MgCl2，2.4mg／mL ATP；荧 光 素 溶 液：0.278mg／mL 荧 光 素，5 mmol／L KH2PO4（pH 7.8））于涡旋混匀器快速混匀后，在荧光检测仪（Promega公司）读取发光值并记录.同时取剩余20μL裂解液上清，通过 Western blotting分析检测绿色荧光蛋白（GFP）表达量作为内标，以矫正系统读数.实验结果为至少5次实验的平均值.

2 结 果

2.1 MdmX能抑制Axin诱导的p53的转录激活

首先，运用荧光素酶报告基因系统检测MdmX对Axin激活p53转录活性的影响.在HEK 293细胞中转入0.5μg的p53－luc报告基因，然后以图1中的各种组合分别转染2μg Axin，3μg HA－MdmX 或将Axin和MdmX共转染，用空载体补平各孔细胞转入的DNA量，保证各蛋白表达水平基本一致，并且在每组细胞中共转染0.2μg的GFP作为内标.图1中的Western blotting结果为细胞中各蛋白的表达情况.可以看到，单转Axin时（第二道），荧光素酶活性增强了9倍左右，说明Axin强烈诱导p53的转录活性.而当MdmX与Axin共转染时（第四道），荧光素酶的活性明显下降，说明MdmX能抑制Axin对p53的激活.

2.2 MdmX与p53的结合域是其抑制Axin激活p53的关键

MdmX是如何抑制Axin对p53的激活成为我们研究的下一个重点.之前的研究发现Mdm2是通过与p53的结合抑制Axin对p53的激活［20］，而MdmX具有与Mdm2相似的p53结合域，为了验证MdmX是否也能通过它与p53的结合对Axin激活p53产生影响，构建了MdmX缺失p53结合域的突变体MdmXΔp53.在HEK 293细胞中以图2中各组合方式转染2μg Axin，3μg MdmX及3μg MdmXΔp53，同时共转染0.5μg p53－luc荧光素酶报告基因和0.2 μg的GFP，用空载体补平各组细胞转入的DNA量，保证各蛋白表达水平基本一致.图2中的 Western blotting结果表示细胞中各蛋白的表达情况.可以看到，MdmXΔp53不能抑制Axin对p53的激活，说明MdmX可能通过与p53的结合抑制Axin对p53的转录激活.

图1 MdmX对Axin激活p53的影响Fig.1 Effect of MdmX on Axin－induced p53transcriptional activation

图2 MdmXΔp53对Axin激活p53的影响Fig.2 Effect of MdmXΔp53on Axin－induced p53transcriptional activation

2.3 MdmX竞争Axin与p53的结合

为了检测MdmX能否与Axin竞争结合p53，从而导致对Axin－p53信号通路的抑制，在HEK 293T细胞中转染2μg Axin，再共转入DNA浓度依次递增（0，2，4，8μg）的 HA－MdmX.转染24h后收集并裂解细胞，用耦联p53多克隆抗体的琼脂糖珠免疫沉淀细胞中内源的p53.Western blotting检测免疫沉淀物和全细胞裂解液，用抗p53的单克隆抗体DO－1、抗Axin和抗HA的抗体分别检测p53、Axin和MdmX的表达情况.如图3所示，随着MdmX表达量的增加，与p53共沉淀的Axin逐渐减少，说明MdmX可以减弱Axin与p53的相互作用.

图3 MdmX对Axin与p53相互作用的影响Fig.3 Effect of MdmX on the interaction between Axin and p53

通过上述荧光素酶报告基因实验，可以得知MdmX的p53结合域是其抑制Axin激活p53的关键，可以推测缺失p53结合域的MdmX是无法与Axin竞争p53结合的.在HEK 293T细胞中转染2 μg Axin，然后共转染不同浓度梯度（3和8μg）的HAMdmX或HA MdmXΔp53.转染24h后收集细胞，用耦联p53多克隆抗体的琼脂糖珠免疫沉淀内源p53，观察共沉淀的MdmX及其突变体的变化.如图4所示，MdmXΔp53由于不能与p53结合，不影响Axin与p53的相互作用，进一步验证了MdmX能通过与p53的结合抑制Axin与p53的相互作用.

图4 MdmXΔp53对Axin与p53相互作用的影响Fig.4 Effect of MdmXΔp53on the interaction between Axin and p53

3 讨 论

MdmX与Mdm2均为p53信号通路中重要的负调控因子.Mdm2的主要功能为介导p53的泛素化降解，从而影响p53的稳定性，而MdmX则主要抑制p53的转录活性［12］.本实验室前期的研究证明Axin／p53活化复合体在p53的转录激活及其诱导的细胞凋亡中起重要作用［20］.本文的研究进一步发现 MdmX对Axin－p53信号通路的抑制与 Mdm2相似，都是通过竞争Axin与p53的结合而实现.这有别于以往认为的两者在作用机制上完全不同，提示结构上的相似性在某些基因调控方面还是起到类似的功能.但两者在Axin／p53活化复合体中的功能是否可以相互替代，或者两者需要协同进行作用应是下一步研究的重点.另外，MdmX能否与Axin／p53复合体中其他成员如HIPK2等发生相互作用而影响p53信号通路的调节，在各种DNA损伤刺激下其表达水平的变化对Axin／p53活化复合体有何影响等问题也很值得继续进行深入的研究.此外，MdmX在Axin－p53信号通路中的抑制作用也为某些肿瘤的临床治疗提供了新的线索.在很多有野生型p53表达的肿瘤中，如乳腺癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤及恶性神经胶质瘤等，发现有MdmX基因的扩增［8］，在这些肿瘤细胞中Axin／p53活化复合体的功能会由于大量MdmX的竞争作用而被抑制.已有研究证明，在一定剂量的抗肿瘤药物阿霉素（doxorubicin）作用下，Axin／p53活化复合体会被诱导大量生成，引起细胞凋亡，抑制肿瘤的形成［20］.但是其有效作用剂量较大，对正常细胞的损伤也很严重，具有很强的毒副作用.如果能加入MdmX与p53结合的阻断剂，使这些MdmX过表达的肿瘤细胞中Axin／p53活化复合体的作用不被 MdmX所抑制，就有望降低阿霉素的用量，减少治疗时对正常细胞的毒副作用，达到更好的肿瘤治疗效果.

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