姜黄素的抗胰腺癌作用及相关机制研究

谷倬宇 李思源 肖智伟 周 婷 李 军△

姜黄素的抗胰腺癌作用及相关机制研究

谷倬宇1,2李思源2肖智伟1,2周 婷1李 军1,2△

目的 探讨姜黄素(curcumin)的抗胰腺癌作用及其可能的机制。方法采用免疫组化法检测35例胰腺癌组织及相邻非癌组织中Smad4、Jab1的表达情况，并从中抽取21例胰腺癌组织测定Jab1与Smad4染色的阳性细胞百分比，分析两者相关性。将人胰腺癌细胞系PANC-1细胞分为PANC-1对照组（不做处理）和PANC-1 curcumin组（含10 μmol/L姜黄素的细胞培养液处理），采用Western Blot检测姜黄素对肿瘤抑制物p53、Smad4及细胞循环抑制剂p27蛋白表达的影响。将人胚肾细胞系293T细胞分为293T对照组（不做处理）、293T curcumin组（含10 μmol/L姜黄素的细胞培养液处理）和293T Jab1组（转染HA-Jab1质粒），采用免疫共沉淀法检测姜黄素对β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达影响。结果与相邻非癌组织比较，胰腺癌组织中Smad4呈低表达，Jab1呈高表达（均P＜0.01），Jab1与Smad4的表达呈负相关(n=21，r=-0.71，P=0.007)。姜黄素可增加PANC-1细胞中Smad4、p53 和p27蛋白表达的水平，降低293T细胞中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平；Jab1可增加293T细胞中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平（均P＜0.05）。结论姜黄素可能通过上调Smad4、p53和p27的蛋白表达进而起到抗胰腺癌作用，其上调Smad4表达的机制可能与其抑制Smad4蛋白的泛素化进程有关，而Jab1也可能通过参与Smad4的泛素化进程影响Smad4蛋白降解。

胰腺肿瘤；姜黄素；Smad4蛋白质；肿瘤抑制蛋白质p53；周期素依赖激酶抑制剂p27；泛素化；Jab1

姜黄素（curcumin）是一种天然植物提取物，在中国及印度已被用作药物来治疗疾病，具有广泛的药理作用，包括抗感染、抗肿瘤、抗氧化及促进伤口愈合等[1]，其抗肿瘤机制在于它能作用于转录因子、生长调节因子、黏附分子、凋亡基因、血管生成调节因子及细胞信号分子等[2-3]。姜黄素作为Jab1相关激酶抑制剂，已有研究证实其在肝癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤中存在抗肿瘤作用[4-5]，然而其在胰腺癌中的作用及作用机制尚不明确。有研究显示在胰腺癌细胞系中Smad4蛋白低表达[6]，但Jab1蛋白的表达情况尚少见报道。本研究通过检测胰腺癌组织中Smad4、Jab1的蛋白表达情况，探讨二者在胰腺癌中的相关性，观察并分析Jab1相关激酶抑制剂姜黄素对胰腺癌细胞系中肿瘤抑制物Smad4、p53和细胞循环抑制剂p27蛋白表达的影响，旨在探讨姜黄素对胰腺癌的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 35例胰腺癌冰冻及石蜡包埋组织来自于我院病理科临床资料完整的胰腺癌手术患者，其中男21例，女14例，年龄60～81岁，平均（70.41±6.32）岁。正常对照组织来自于胰腺癌相邻非癌组织。人胰腺癌细胞系PANC-1和人胚肾细胞系293T购自中国科学院上海细胞库。pMSCVneo/ HA-Jab1、pMSCVneo/Flag-Smad4逆转录病毒质粒由美国阿拉巴马伯明翰大学惠赠。兔抗人Jab1多克隆抗体、鼠抗人Smad4单克隆抗体、p27抗体、p53抗体、β-TrCP1抗体购自Santa Cruz公司，β-actin抗体、Flag抗体、姜黄素购自Sigma公司，HA抗体购自CRP公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组处理及转染 293T细胞、PANC-1细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。细胞贴壁生长，每3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。将PANC-1细胞分为2组，不做任何处理的细胞为PANC-1对照组，含10 μmol/L姜黄素的细胞培养液处理的细胞为PANC-1 curcumin组。293T细胞长至80％密度时转染Flag-Smad4质粒，转染24 h后收获细胞，采用完全随机设计方法将细胞分为3组，不做任何处理的细胞为293T对照组，含10 μmol/L姜黄素的细胞培养液处理的细胞为293T curcumin组，再次转染HA-Jab1质粒的细胞为293T Jab1组。

1.2.2 免疫组化染色 将4 μm的贴邻切片脱蜡水化后，用新鲜配制的3％双氧水室温封闭10 min，PBS洗后滴加正常的山羊血清封闭液20 min，甩去多余液体。4℃滴加一抗过夜，一抗稀释1∶100的比例，37℃复温45 min，室温下滴加生物素化二抗30 min，镜下控制DAB显色后用自来水清洗，苏木素复染。在未知病理资料情况下，由2名病理科医生判定，结果一致可判断为阳性。从35例胰腺癌标本中随机抽取21例测定同一张切片上Jab1与Smad4染色的阳性细胞百分比，分析Jab1与Smad4的关系。

1.2.3 Western Blot检测 PANC-1细胞处理24 h后，预冷PBS洗涤，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g 4℃离心，收集上清后加入100 μL 1×SDS上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白质变性，用10％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入Smad4、p53、p27及β-actin一抗4℃过夜，过夜后加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育1 h，然后于Bio-Rad凝胶成像仪中进行显影，条带灰度值用Bio-Rad凝胶成像系统进行图像分析，重复3次。

1.2.4 免疫共沉淀反应 293T细胞处理6 h后，预冷PBS洗涤加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g 4℃离心，收集上清，加入β-TrCP1抗体，4℃缓慢摇动过夜，次日加入30 μL protein G beads，4℃缓慢摇动2 h，1 000×g 4℃离心5 min，用不含PMSF的细胞裂解液洗涤beads 3次，加入100 μL 1×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，离心取上清做Western Blot检测。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 18.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法；相关分析行Pearson相关。计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Smad4、Jab1在胰腺癌及相邻非癌组织中的表达 Smad4在胰腺癌组织中的阳性表达率明显低于相邻非癌组织，Jab1在胰腺癌组织中的阳性表达率明显高于相邻非癌组织（均P＜0.01），见表1。21例胰腺癌标本中Jab1阳性细胞百分比与Smad4阳性细胞百分比呈负相关(r=-0.71,P=0.007)，见图1。

2.2 姜黄素对胰腺癌细胞中Smad4、p53及p27蛋白表达的影响 与PANC-1对照组相比，姜黄素可明显增加PANC-1细胞中Smad4、p53及p27蛋白的表达水平（P＜0.01），见图2、表2。

Tab.1 Protein expressions of Smad4 and Jab1 in PC tissues and pericarcinomatous tissues表1 Smad4、Jab1在胰腺癌及相邻非癌组织中的表达例(％)

Fig.1 The correlation of Smad4 expression with Jab1 expression in pancreatic cancer tissues图1 胰腺癌组织中Smad4与Jab1表达的相关性

Fig.2 Protein expression levels of Smad4,p53 and p27 in two groups图2 2组细胞中Smad4、p53及p27蛋白的表达水平

Tab.2 Comparison of protein expression levels of Smad4，p53 and p27 between two groups表2 2组细胞中Smad4、p53及p27蛋白的相对表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of Smad4，p53 and p27 between two groups表2 2组细胞中Smad4、p53及p27蛋白的相对表达水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

组别PANC-1对照组PANC-1 curcumin组t Smad4 0.42±0.05 0.71±0.04 61.537＊＊p53 0.24±0.04 0.52±0.03 94.080＊＊p27 0.35±0.06 0.93±0.02 252.300＊＊

2.3 姜黄素对293T细胞中泛素化连接酶β-TrCP1 与Smad4相互作用的影响 与293T对照组相比，293T curcumin组中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平明显降低，293T Jab1组中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平明显升高（均 P＜0.05）。见图3、4。

Fig.3 The protein expression levels of the combination of β-TrCP1 and Smad4 in three groups图3 3组细胞中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平

Fig.4 Comparison of protein expression levels of the combination of β-TrCP1 and Smad4 in three groups图4 3组细胞中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平比较

3 讨论

胰腺癌是一个多基因、多步骤的发展过程，涉及多个原癌基因和抑癌基因的突变，其中最主要的是K-ras、p53、p16、DPC4/Smad4基因。近年来的研究证实抑癌基因Smad4/DPC4与胰腺癌的发病机制密切相关[7]。本研究结果显示，在胰腺癌组织中，Smad4蛋白表达明显降低，此结果与国外研究结果一致[8]。Jab1即CSN5，是COP9信号复合物（CSN）的第5个组分，已有研究发现，Jab1在多种肿瘤中高表达，包括胰腺癌[9]，但具体机制不明。本研究中Jab1在胰腺癌组织中呈高表达，与Smad4的表达呈负相关，提示Jab1高表达及Smad4低表达与胰腺癌的发生发展可能密切相关，二者可能是胰腺癌发病机制的一个重要组成部分。

姜黄素作为Jab1相关激酶抑制剂，已证实在许多肿瘤中具有抗肿瘤活性[10]，有研究表明其作用机制可能与Notch-1及核因子（NF）-κB信号途径及其下游基因相关[11]，但具体机制不明。He等[12]研究发现，姜黄素可通过上调结肠癌细胞中p53的表达进而加速癌细胞的凋亡，p53的表达很可能是姜黄素的一个重要调控点。Maher等[13]在宫颈癌细胞中也证实了姜黄素可通过调控p53蛋白表达参与宫颈癌的发生发展。Aggarwal等[14]在人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中也发现姜黄素可通过上调细胞中的p53 及p27的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示，姜黄素可上调胰腺癌细胞中肿瘤抑制物Smad4、p53和细胞循环抑制剂p27的蛋白表达，提示姜黄素可能通过上调胰腺癌细胞中Smad4、p53 及p27的表达进而起到抗胰腺癌作用。

泛素-蛋白酶体途径是主要调节蛋白降解的系统之一，研究表明泛素化连接酶β-TrCP1在Smad4蛋白的泛素化及进一步降解中起着重要作用[15]。本研究结果显示，293T curcumin组中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平明显低于对照组，提示姜黄素可抑制β-TrCP1与Smad4的相互结合，从而可能通过抑制Smad4的泛素化，进而减少Smad4作为底物被泛素-蛋白酶体系统降解，使其蛋白的稳定性及表达增加。而 293T Jab1组中β-TrCP1与Smad4结合的蛋白表达水平明显高于对照组，提示Jab1可能通过促进Smad4的泛素化，使Smad4蛋白的稳定性及表达下降，结合胰腺癌组织中Jab1与Smad4的蛋白表达呈负相关，也进一步提示Jab1与Smad4的不稳定密切相关，姜黄素可能通过抑制Smad4的泛素化进程进而抑制其降解，从而上调Smad4表达起到抗胰腺癌作用。

综上所述，姜黄素作为Jab1相关激酶抑制剂可能通过上调Smad4、p53和p27的蛋白表达进而起到抗胰腺癌作用，其上调Smad4表达的机制可能与其抑制Smad4蛋白的泛素化进程有关，而Jab1也可能通过参与Smad4的泛素化进程影响Smad4蛋白降解。

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（2014-05-09收稿 2014-08-12修回）

（本文编辑 陈丽洁）

The Anti-Tumor Effect and Mechanism of Curcumin in Pancreatic Cancer

GU Zhuoyu1,2，LI Siyuan2，XIAO Zhiwei1,2，ZHOU Ting1，LI Jun1,2△
1 First Affiliated Hospital,Medical College of Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 Medical College of Shihezi University,Key Laboratory of Ministry of Education,Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases
△

E-mail：xjlijun@163.com

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect and mechanism of curcumin in pancreatic cancer(PC).MethodsSmad4 and Jab1 expressions were detected by immunohistochemistry in tumor tissues and pericarcinomatous tissue from 35 PC cases,and the correlation of Smad4 and Jab1 were analyzed based on the percentage of positive staining intissues from 21 random selected PC cases.The effect of curcumin on expressions of tumor suppressors p53,Smad4 and cell cycle inhibitor p27 were examined by Western Blotting after human pancreatic cancer cell line PANC-1 were divided into PANC-1 control group(no treatments were given)and PANC-1 curcumin group(treated with cell culture medium containing 10 μmol/L curcumin).The effect of curcumin on expressions of combination of β-TrCP1 and Smad4 was examined by Co-Immunoprecipitation after human embryonic kidney cell line 293T were divided into 293T control group(no treatments were given),293T curcumin group(treated with cell culture medium containing 10 μmol/L curcumin)and 293T Jab1 group(transfected by HA-Jab1 plasmid).ResultsCompared with expressions in pericarcinomatous tissues,Smad4 was down regulated while the expression of Jab1 was upregulated in PC tissues(P＜0.01),and the expression of Smad4 was negatively correlated with the expression of Jab1(n=21,r=-0.71,P=0.007).After treated with curcumin,the protein expression of p53,Smad4and p27 was increased in PANC1 cell,and the protein expression of the combination of β-TrCP1 and Smad4 was decreased in 293T cell(P＜0.05).After transfected by HA-Jab1 plasmid,the protein expression of the combination of β-TrCP1 and Smad4 was increased in 293T cell(P＜0.05).ConclusionCurcumin may have suppression effect of PC through increasing the protein expression of p53,Smad4 and p27,and the mechanism of Smad4 upregulation may be related with the inhibition of Smad4 ubiquitination process,while Jab1 may be also involved in Smad4 degradation through ubiquitination.

pancreatic neoplasms;curcumin;Smad4 protein;tumor suppressor protein p53;cyclin-dependent kinase inhibitor p27;ubiquitination;Jab1

R735.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.003

新疆生产建设兵团国际合作基金资助项目（2011BC005）

1石河子大学医学院第一附属医院（邮编832002）；2石河子大学医学院，新疆地方与民族高发病教育部重点实验室

△通讯作者 E-mail:xjlijun@163.com