β2-GP1、VEGF、TF与大鼠DVT形成的关系

宋 恩 李光第 娄振凯 王 扬 赵学凌

β2-GP1、VEGF、TF与大鼠DVT形成的关系

宋 恩 李光第 娄振凯 王 扬 赵学凌△

目的 建立大鼠下腔静脉狭窄法深静脉血栓（DVT）模型，检测大鼠血液中β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管内皮生长因子（VEGF）、组织因子（TF）表达变化，研究其与DVT形成的关系。方法70只SD大鼠，随机分为对照组（10只），假手术组（30只），模型组（30只），模型组于造模后2 h、8 h、24 h分为3个亚组，采集各组大鼠下腔静脉血5 mL，ELISA法检测β2-GP1、VEGF、TF水平。结果大鼠血液中β2-GP1、VEGF、TF表达在对照组与假手术组间比较无统计学差异（P＞0.05），造模后2～24 h，β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表达呈上升趋势，24 h时达峰值，高于对照组、假手术组、造模后2 h组和造模后8 h组（P＜0.01），其余4组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论大鼠DVT形成过程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促进血栓形成的作用。

β2糖蛋白Ⅰ；血管内皮生长因子类；凝血致活酶；静脉血栓形成；大鼠，Sprague-Dawley

深静脉血栓(deep vein thrombosis，DVT)是指血液在深静脉血管腔内异常凝结，导致血管管腔阻塞，静脉血回流受阻，继发一系列相应的临床症状[1]。下肢深静脉血栓形后，栓子可脱落，并随血流堵塞肺动脉，造成致命性肺栓塞(pulmonary embolism，PE)[2]。目前DVT研究主要集中在分子机制的探索，本实验建立DVT大鼠模型，检测并分析β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管内皮生长因子（VEGF）、组织因子（TF）在大鼠血液中的表达变化，初步探讨其与DVT形成的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠β2-GP1、VEGF、TF的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Ebioscience公司；微量取样器购自Eppendorf公司，冷冻离心机购于Thermo公司，酶标仪购于Bio-Tek公司；各种规格的离心管、枪尖、PCR管购于Axygen公司。二甲苯、无水乙醇、冰乙酸、95％乙醇、苏木素、伊红购于天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 大鼠DVT模型建立及分组 70只SPF级SD大鼠，购自昆明医科大学医学动物实验中心，动物生产许可证号：SCKK（滇）2005-0008，雌性，体质量（180±40）g。光线、通风良好，自由饮水、进食。所有动物相关实验都经昆明医科大学动物实验和伦理委员会批准。动物实验随机分为对照组10只，假手术组30只，模型组30只，模型组随机分为造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h组，每组10只。对照组：SD大鼠不做任何处理，正常喂养。假手术组：大鼠腹腔内注射5％水合氯醛6 mL/kg麻醉，0.5％碘伏消毒、铺巾，在剑突下1 cm处，沿腹中线取1.5 cm切口，逐层切开大鼠皮肤、皮下肌层、腹膜，将腹腔内容物剥离出腹腔外，暴露及分离下腔静脉，还纳腹腔内容物，逐层关腹，保温，正常喂养。模型组：大鼠麻醉、消毒、铺巾，切开腹腔、暴露同假手术组，此时可见暴露的下腔静脉，于左肾静脉与下腔静脉交汇处下方，分离下腔静脉后，用5-0爱惜康缝合线沿下腔静脉走形放置，再用4-0爱惜康缝合线结扎此处下腔静脉，再抽去5-0爱惜康缝合线，分离出交汇于下腔静脉在髂静脉上方的2条侧支分支静脉并用5-0爱惜康缝合线结扎，见图1。还纳腹腔内容物逐层关腹缝合，保温，正常喂养。

Fig.1 Rat inferior vena cava partial stasis(narrow)DVT model图1 大鼠下腔静脉狭窄法DVT模型

1.3 实验大鼠样本取材、处理 假手术组及模型组的造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h组按不同时点（造模后2 h、8 h、24 h）打开腹腔后观察造模段下腔静脉肿胀度、颜色、局部组织反应程度。从大鼠下腔静脉结扎处上方（肾静脉以上）获取静脉血液样本5 mL，离心机3 000 r/min离心15 min，分离有核细胞与血浆，分装后，分别置于-80℃深低温冷冻冰箱备用。同时，取距结扎线1.0 cm的下腔静脉及血栓栓体，置于4％多聚甲醛固定后送石蜡切片，HE染色观察血栓形成状态。

1.4 ELISA检测大鼠血中β2-GP1、VEGF、TF表达 ELISA检测步骤严格按Ebioscience试剂盒说明书标准操作进行，按照ELISA说明书稀释标准蛋白浓度，顺序添加反应物，在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD）值，绘制标准曲线。根据标准曲线来换算出待测样品的浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，对所有测量的数值进行统计学分析。所有数据以均数±标准差（±s）表示，各组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比较采用Tukey HSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物一般情况、肉眼观察及病理学检测结果 假手术组大鼠因麻醉原因死亡1只，造模后8 h、 24 h组大鼠各死亡1只，原因为术后伤口渗血过多，其余实验大鼠正常。对照组：肉眼观察，下腔静脉通畅，透过管壁可见管腔内暗红色流动血液，腹腔内未见有静脉血管扩张。取材血管管径粗细均匀，管壁薄而柔软，富有弹性，内膜面呈乳白色，平整、光滑。镜下观察：整个血管内膜表面平整，内皮细胞大小均匀、排列整齐，管腔中无血栓形成。假手术组：下腔静脉结扎后，在结扎处下方的下腔静脉立即膨胀，解除结扎线后，膨胀消失，下腔静脉直径未见明显变化，血管管径粗细均匀，下腔静脉通畅，可见血管内有暗红色血液流动，血管富有弹性。镜下观察：整个血管内膜表面平整，内皮细胞大小均匀、排列整齐,管腔中无血栓形成，见图2。模型组：下腔静脉结扎后，在结扎处下方的下腔静脉立即膨胀，血管颜色变暗，血管弹性可；造模后2 h见结扎处下方的下腔静脉血管内有黑色凝块样物质形成，压迫血管，凝块样物质可移动，镜下观察见不完全血栓形成，同时可见少量炎性细胞侵润，血栓大部分为纤维素和中性粒细胞；造模后8 h，下腔静脉颜色变黑，弹性下降，血管内出现白色和黑色混合样凝块样物质，镜下观察见完全血栓形成，血栓充满整个管腔，静脉壁内皮细胞剥脱，下层裸露，炎性细胞浸润加重，血栓与内皮细胞无粘连；造模后24 h，下腔静脉直径继续增大达到峰值，镜下观察见血栓充满整个管腔，同时与大部分静脉壁粘连紧密，出现机化现象，炎性细胞浸润进一步加重，见图3。

Fig.2 Venous tissue(HE,×40)in normal control group(left)and sham operation group(right)图2 对照组（左）、假手术组（右）静脉壁组织(HE，×40)

2.2 大鼠血浆中β2-GP1、VEGF、TF表达 造模后2～24 h,血液中的β2-GP1、VEGF、TF表达逐渐增加。造模后24 h达峰值，较对照组、假手术组及造模后2 h、8 h组均增高，差异有统计学意义，β2-GP1、VEGF、TF在其余4组间比较差异无统计学意义，见表1。

Fig.3 Venous tissue of rat IVC narrow DVT model at the 2ndhour,the 8thhour and the 24thhour after operation(HE,×40)and venous thrombus图3 大鼠下腔静脉狭窄法术后2 h、8 h、24 h静脉壁组织切片染色（HE，×40）及静脉血栓形成

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3组TF、VEGF和β2-GP1表达水平比较 （±s）

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3组TF、VEGF和β2-GP1表达水平比较 （±s）

＊＊P＜0.01;a与造模后24 h组比较，P＜0.01

组别正常对照组假手术组造模后2 h组造模后8 h组造模后24 h组F n 10 29 10 99 TF（ng/L）150.965±25.511a168.237±30.170a181.162±32.844a203.051±44.481a326.781±84.550 27.015＊＊VEGF（ng/L）190.810±76.009a206.523±78.865a225.726±67.380a258.827±53.851a370.979±147.822 7.178＊＊β2-GP1（μg/L）2 934.840±395.284a3 150.027±509.658a3 180.955±552.821a3 356.866±460.596a4 456.005±417.372 15.093＊＊

3 讨论

DVT是静脉回流障碍性疾病，其临床主要表现为肢体肿胀、疼痛、皮温改变和功能障碍，主要好发于下肢，常见于骨科大手术后。DVT形成后的血栓脱落是引起肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）栓子的主要来源，PTE是DVT的严重并发症同时也是PE的主要类型。PE在西方已经成为继缺血性心脏性疾病和脑卒中后的又一大常见致死因素，其病死率高达15％～20％，因此对DVT的诊断和治疗应给予高度的重视。早期预防和积极治疗可以将病死率降低到5.8％[3]。DVT的形成机制较为复杂，Virchow于1856年提出的内皮细胞损伤、血流动力学改变、血液高凝状态是导致血栓形成的三大因素理论[4]，这一理论长期以来得到普遍公认，但是随着医学的不断发展和研究不断的深入，尤其是分子生物学、基因工程技术飞速发展，在对Vrichow的理论完善的同时也对其提出了质疑，如大部分的DVT患者血管壁无明确损伤[5]。目前DVT被公认为是一个多系统、多因素，形成过程复杂的疾病，参与其中的包括血管内皮细胞、血小板、凝血与抗凝血系统、纤溶与抗纤系统、炎症反应、血液流变学及血液动力学等共同作用的结果，其调控网络极为复杂多变，是一个动态变化的过程。因此，着手于分子、基因和蛋白水平来研究DVT的发生、发展及消退过程，对深入研究DVT的形成就显得极为重要[6]。

β2-GP1在血浆中以环状和链状两种构象存在，在生理情况下循环血液中的β2-GP1是以环状结构存在的，当环状的β2-GP1被负性磷脂捕获后，环状结构展开形成链状结构的β2-GP1，暴露I区抗原表位。1个抗β2-GP1抗体可以同时与2个β2-GP1结合，形成二聚化的β2-GP1，从而引发了β2-GP1抗体/β2-GP1与细胞的结合进而影响细胞的生物功能[7]。关于β2-GP1，目前研究主要集中在自身免疫系统疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、抗磷脂抗体综合征。近年来研究发现β2-GP1抗体阳性患者即使无免疫系统疾病，也可发生动静脉血栓，特别地代谢综合征患者，进一步研究表明，在SLE患者中β2-GP1抗体加速血小板凝集，并作用于内皮细胞，与磷脂质等结合导致不同抗体的形成，发生抗磷脂抗体综合征，从而导致血栓等发生[8]。VEGF是由2 个17～22 ku亚基构成的糖蛋白，在缺血、缺氧等应激状态下，均可引起VEGF水平的增高。VEGF具有促进细胞内细胞Ca2+聚集的作用、增加血管的通透性、促进血管生成及动员内皮祖细胞等生物学功能。VEGF是一种对血管生长有强力诱导并特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，是促进血管生长的关键因子[9]。Olszewska-Pazdrak等[10]发现在人体中，慢性缺氧可导致内皮细胞损伤，引起VEGF表达下降，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAKP）途径，可引起内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及一氧化氮（NO）的分泌减少，减少新生血管的生成。Durán等[11]发现，VEGF可以通过蛋白激酶B（PKB/AKT）等途径，诱导eNOS的产生，调控NO生成，影响血管内皮细胞的通透性及稳定性，减少血管内皮细胞的损伤。Lu 等[12]发现接头蛋白（Gab1）因子通过蛋白激酶A （PKA）与eNOS途径，来调节血管再生，从而能调节产后缺血和VEGF的表达。在外源性凝血途径中，TF作为该凝血途径的启动子发挥不可或缺的作用。通常TF主要以两种形式存在：一种是作为跨膜蛋白，当血管壁受损，内皮下组织暴露到循环血液中时TF被激活；另一种以可溶解的裂解形式存在。当血管壁受损发生炎性反应时，机体就会产生大量炎性细胞和炎性因子[13]。所以血栓性疾病的发生发展与TF的异常表达有着密切的关联。相关研究发现抗血小板聚集药物阿卡地新（Acadesine）可通过激活PI3K-AKT信号通路来抑制TF在内皮细胞及单核巨噬细胞中的表达[14]。

本研究在动物实验中，建立大鼠下腔静脉狭窄法DVT模型，检测大鼠造模后不同时点（2 h、8 h、24 h）β2-GP1、VEGF、TF的表达，发现对照组与假手术组血液中β2-GP1、VEGF、TF无明显差异，造模后2～24 h,β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表达逐渐上升，24 h时达峰值。提示在DVT形成过程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促进血栓形成的作用。

DVT是一个多因素多系统的复杂疾病，目前研究热点集中在内皮细胞损伤、内皮细胞损伤介导的血小板活化、炎症因子激活等一系列关键、紧密联系的环节上，本研究发现的，β2-GP1、VEGF、TF在DVT形成过程中，可能起到关键作用。为进一步在细胞层面研究、阐明其机制打下重要基础。

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（2014-08-22收稿 2014-08-30修回）

（本文编辑 魏杰）

The Correlation between β2-GP1，VEGF and TF with Rat DVT Formation

SONG En,LI Guangdi,LOU Zhenkai,WANG Yang,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the 1stAffiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China
△

E-mail：zxidoctor@hotmail.com

ObjectiveTo build rat DVT inferior vena cava partial stasis(narrow)model,to detected the expression of β2-GP1,VEGF and TF in rat blood,and to investigat the correlation between β2-GP1,VEGF and TF with DVT.Methods SD rats(n=70)are divided into control group(n=10),sham operation group(n=30)and the model group(n=30)randomly and DVT model was built by the inferior vena cava partial stasis(narrow)after 2 h,8 h and 24 h respectively.In each time point,ten rats were taken in each group,inferior vena cava blood were collected while β2-GP1,VEGF and TF expression were detected by ELISA.ResultsIn rat experiment,compared with control group,there was no significant change inexpression of β2-GP1,VEGF and TF in sham operation group(P＞0.05).Levels of β2-GP1,VEGF and TF were increased at the 2ndhour and 8thhour then peak at the 24thhour which was higher than those in the 24thhour control group and in Sham group and it was also higher than those in the 2ndhour and the 8thhour in model group with statistical significant difference(P＜0.01).ConclusionBased on the above experimental data,in rat DVT formation process,β2-GP1, VEGF and TF may play an important role in promote DVT formation.

beta2-glycoproteinⅠ;vascular endothelial growth factors;thromboplastin;venous thrombosis;rats, Sprague-Dawley

R654.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.007

国家自然科学基金资助项目（81060151）；云南省卫生科技计划项目（2012ws0007）；云南省科技厅重点新产品开发计划项目（2010BC010）

昆明医科大学第一附属医院骨科（邮编650032）

△通讯作者 E-mail:zxidoctor@hotmail.com