CD36 rs3211956和rs7755单核苷酸多态性与早发冠心病的相关性

赵伟伟 车京津 张彦彦 邵元霞 王俊乾

临床研究

CD36 rs3211956和rs7755单核苷酸多态性与早发冠心病的相关性

赵伟伟 车京津△张彦彦 邵元霞 王俊乾

目的 探讨早发冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）的危险因素，及CD36基因rs7755和rs3211956单核苷酸多态性（SNP）与早发CHD的相关性。方法连续筛选冠状动脉造影证实的早发冠脉严重三支病变者（病变组）102例及冠脉造影正常者（正常组）72例，对比2组CHD的传统危险因素，并用质谱法检测所有入选者CD36 rs7755和rs3211956位点基因型，分析早发CHD的独立危险因素。结果传统危险因素中，男性、糖尿病、高血压、高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）是早发CHD的独立危险因素。病变组中rs3211956的GT基因型分布低于正常组（χ2=8.042，P=0.005），而TT基因型分布高于正常组（χ2=6.191，P=0.014）；TT基因型者较含G等位基因者的体质指数（BMI）水平增高（P=0.037）。病变组rs7755的G等位基因的频率高于正常组（χ2=3.636，P=0.047）；GG基因型的BMI水平高于A等位基因携带者（P＜0.001），而HDL-C水平低于另两种基因型者（P＜0.001）。Logistic回归分析显示在分别调整了混杂因素后，rs3211956基因型GG、TT及rs7755基因型GG、GA均为早发CHD的独立危险因素。结论CD36 rs3211956、rs7755的SNP可能是致早发CHD的独立危险因素，且可能通过影响BMI和HDL-C而影响早发CHD的发生。

冠心病；多态性,单核苷酸；抗原,CD36；危险因素；rs3211956；rs7755

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的发病率逐年上升，且呈年轻化趋势[1]。动脉粥样硬化(AS)是由遗传和环境等多种因素共同作用的结果[2]，因此研究早发CHD的危险因素和致早发CHD的遗传背景，有可能早期识别早发CHD高危人群，进而早期预防。变性的低密度脂蛋白（LDL）和泡沫细胞是AS形成的两大要素。清道夫受体（scarenger receptor，SR）是介导巨噬细胞摄取变性LDL形成泡沫细胞的重要介质，而CD36是B族SR中介导氧化LDL清除的主要成员[3]。有研究证实CD36基因多态性与脂质代谢异常[4]、胰岛素抵抗[5]及代谢综合征（MS）[6]有关，这些因素均为早发CHD的危险因素，但目前尚缺乏CD36基因多态性与早发CHD关系的报道。本研究旨在探讨CD36 rs7755和rs3211956单核苷酸多态性（SNP）与早发CHD的相关性。

1 对象与方法

1.1 入选及排除标准 连续筛选2010年10月—2012年12月我院心内科拟诊断CHD并接受冠状动造影检查的住院患者，CHD发病年龄男性＜55岁，女性＜65岁。根据冠脉造影结果入选病例，按照定量冠脉造影法左前降支、左回旋支、右冠脉或左主干病变及右冠脉均有面积≥50％的狭窄，且至少一支面积≥70％狭窄作为病变组；三支冠脉均光滑无明显狭窄为正常组。病变组男性、糖尿病、饮酒史、吸烟史和早发CHD家史比例高于正常组，见表1。排除标准：（1）合并严重肝肾功能异常，肝炎或丙氨酸转氨酶（ALT）＞80 U/L，血肌酐（Scr）≥178 μmol/L。（2）合并严重感染、恶性肿瘤、甲状腺疾病等。（3）合并血液系统疾病，如严重贫血、骨髓增生性疾病、凝血功能障碍性疾病等。（4）合并自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。（5）严重心脏瓣膜病患者。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups表1 病变组和正常组基本临床资料比较

1.2 方法

1.2.1 实验数据收集 测量空腹体质量、身高，计算体质指数（BMI）=体质量/身高2(kg/m2)。记录性别、年龄、糖尿病（DM）、高血压、脑卒中病史、吸烟史。采集空腹肘正中静脉血，测定血脂、空腹血糖（FBG）、肝肾功能等临床生化指标；另留取肘正中静脉血3 mL，用于择期提取基因组DNA。

1.2.2 DNA提取及检测 采用淋巴细胞分离液法提取白细胞，置于-80℃冻存。应用浓盐法提取DNA，利用分光光度法检测DNA的含量，分别读取波长280 nm、260 nm、230 nm下的光密度（OD）值，记录样本 DNA的浓度和纯度。rs3211956和rs7755基因多态性采用质谱法测定。

1.2.3 冠脉造影及结果分析 采用荷兰飞利浦公司FD20数字减影血管仪，采用Judkins法取7个体位投照进行选择性冠状动脉造影，左冠状动脉采用左前斜头位、右前斜头位、左前斜足位、右前斜足位，右冠状动脉采用左前斜、头倾位、右前斜。结果由2名心导管专业医师评定。按照定量冠状动脉造影（Quantitative Coronary Angiography,QCA）法判定冠状动脉狭窄处直径比狭窄近心端正常冠状动脉直径减少的百分比。当主要冠脉或其主要分支面积≥50％的狭窄即诊断为冠心病。分别对左主干、左前降支、回旋支、右冠脉进行狭窄程度评定，其主要分支如对角支、钝缘支归属相应主支进行统计。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用t检验或单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料采用中位数和四分位数M（P25，P75）表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用例（％）表示，组间比较采用χ2检验；拟和优度χ2检验基因型分布是否符合Hardy Weinberg平衡。危险因素分析应用多元Logistic回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组实验室指标比较 病变组白细胞（WBC）、FBG、BMI、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肌酐（Scr）、尿酸（UA）水平均高于正常组；而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著低于正常组（P＜0.05或P＜0.01）；2组血小板（Plt）、纤维蛋白原（Fbg）、极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、尿素氮（BUN）水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

2.2 基因检测情况

2.2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验 分别对CD36基因座上rs3211956和rs7755的SNP基因型进行拟和优度χ2检验。结果显示这2个基因位点的SNP基因型在2组间的频率分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

2.2.2 rs3211956与rs7755的基因型及等位基因在2组的分布 rs3211956基因SNP，基因型（TT/TG/ GG）在病变组与正常组的分布差异有统计学意义（P＜0.05），即病变组中GT基因型分布低于正常组，而TT基因型高于正常组，2组的等位基因（G/T）分布差异无统计学意义，见表3。rs7755基因SNP，病变组与正常组的基因型（AA/AG/GG）分布差异无统计学意义，但病变组G等位基因频率高于正常组，见表4。

Tab.2 Comparison of clinical data between two groups表2 病变组和正常组实验室指标比较

Tab.3 Distribution of rs3211956 SNP genotypes and alleles in two groups表3 2组患者rs3211956 SNP基因型和等位基因分布例（％）

2.2.3 CD36基因rs3211956、rs7755基因型分布及临床资料比较 （1）rs3211956：TT基因型者的BMI水平高于 GG基因型者（P＜0.05），见表 5。（2）rs7755：GG基因型者的BMI水平高于AG和AA基因型者（P＜0.05），而GG基因型者的HDL-C水平则低于AG和AA基因型者（P＜0.05）；按照A等位基因显性遗传模型，GG基因型者BMI高于AA+AG基因型者（kg/m2：27.31±2.73 vs 24.53±3.25，t=3.614，P＜0.05）；HDL-C的水平较AA+AG组低（mmol/L：1.21±0.35 vs 1.52±0.74，t=5.072，P＜0.05），见表6。

2.2.4 Logistic回归分析 为评价 CD36基因rs3211956和rs7755的SNP在众多致CHD危险因素中的致病强度，应用二分类非条件逐步Logistic回归分别对其进行分析。以冠脉是否为严重三支病变为应变量（0=冠脉造影正常，1=冠脉严重三支病变），以性别（0=女性，1=男性）、有无吸烟史、早发CHD家族史、脑卒中、高血压、DM、MS、肥胖、高TG血症、高TC血症、低HDL-C血症、高LDL-C血症（0=无，1=有）及rs3211956基因多态性（杂合GT=1，纯合GG+TT=0）为自变量进行多元Logistic回归分析。结果显示：男性、有高血压、糖尿病、低HDL-C血症、高LDL-C血症为发生严重冠脉三支病变的危险因素，携带杂合GT基因型为保护因素，见表7。

Tab.5 Clinical characteristics of rs3211956 genotypes表5 rs3211956各基因型临床特点

采用上述变量赋值标准对变量进行赋值[自变量rs7755基因多态性（隐性AA=0，显性GG+GA= 1）]，进行多元Logistic回归分析。结果显示：男性、有高血压、糖尿病、低HDL-C血症、高LDL-C血症、携带G等位基因为发生严重冠脉三支病变的危险因素，见表8。

Tab.6 Clinical characteristics of rs7755 genotypes表6 rs7755各基因型临床特点

Tab.7 Results of multivariate Logistic regression analysis of rs3211956表7 rs3211956多元Logistic回归分析结果

Tab.8 Results of multivariate Logistic regression analysis of rs7755表8 rs7755多元Logistic回归结果

3 讨论

3.1 CHD的经典危险因素与早发CHD 本研究显示，病变组男性比例、饮酒史、吸烟史、早发CHD家族史、糖尿病所占比例，WBC、FBG、BMI、TG、TC、LDL-C、Scr、UA水平均显著高于对照组；HDL-C则显著低于对照组，在CHD的经典危险因素方面与以往的研究报道相似[7]。Logistic回归分析显示，男性比例、DM、高血压、高LDL-C血症、低HDL-C是早发CHD的独立危险因素。

3.2 CD36的致动脉粥样硬化作用 AS是CHD发生、发展的基础，其形成的一个基本特征是源于巨噬细胞的泡沫细胞形成。这些泡沫细胞中的胆固醇和胆固醇酯来源于变性的脂质，主要为氧化LDL（ox-LDL）[8]。Endemann等[9]发现CD36可通过介导巨噬细胞摄取ox-LDL，形成泡沫细胞。此后关于CD36 在AS中作用的研究逐渐深入。Piechota等[10]通过分离急性冠脉综合征（ACS）患者外周血中单核细胞，证实ACS组和健康对照组的血液中ox-LDL无差异，但ACS组单核细胞表面的CD36的表达是健康对照组的6倍。还有研究提示CD36的低表达可延缓AS病变的发生和发展[11]。以上从正反两方面证实了CD36在致动脉粥样硬化性心脏病方面的重要作用。

在人类的基因组中，编码CD36的基因位于7q11.2染色体上[12]。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90％以上。随着基因分子生物技术的发展，CHD在基因水平上的研究逐步深入，CD36的SNP也越来越受到重视。

3.3 CD36基因rs3211956和rs7755基因多态性与早发CHD rs3211956位于CD36DNA序列的3′端。本研究中，病变组中rs3211956杂合基因型(GT)分布显著低于正常组，显示出杂合子对于冠脉粥样硬化的保护作用。目前，对CD36基因杂合子的保护性或易感性方面的报道比较少。Banerjee等[13]通过对北印度人群CD36 rs1761667(G＞A)的SNP与2型糖尿病的关系进行研究，提出杂合基因型（AG）与2型糖尿病显著相关。而本研究中TT基因型在病变组中分布显著高于正常组，则提示TT基因型有致AS作用。与之相似的，美国一项研究通过对比急性心肌梗死与稳定型心绞痛人群的 CD36 rs3211956（G/T）基因分布，证实T等位基因和急性心肌梗死显著相关[14]。本研究还显示rs3211956的SNP中不同基因型间的BMI差异有统计学意义，TT基因型者的BMI水平较高。相似的是，Heni等[15]通过对1 790例有患DM风险的欧洲人的4个CD36位点的SNP进行分析，也提示rs3211956（T/G）SNP不同基因型间的BMI差异有统计学意义（TT＞TG＞GG，TT+TG＞GG，P＜0.01）。

CD36 rs7755位于CD36DNA序列的3′端的非编码区，对其研究大多集中在MS方面。Love-Gregory等[16]通过对2 020例非裔美国人的CD36 rs7755 的SNP与MS及脂质代谢的关系进行研究，结果显示CD36 rs7755的SNP与BMI＞30 kg/m2及腹围＞100 cm有关，rs7755的G等位基因是MS的独立危险因素。本研究显示GG基因型携带者的BMI水平显著高于AA基因型患者和携带A等位基因的患者。日本一项对515例健康青年人的研究显示，CD36 rs7755（A/G）等位基因G与LDL-C和TC呈正相关（r分别为0.13和0.12，P＜0.01），但是与BMI无相关性，多因素分析显示CD36 rs7755的G等位基因是高LDL-C的独立危险因素[17]。本研究未观察出CD36 rs7755SNP与LDL-C之间的联系，但GG基因型者的HDL-C水平显著低于AG和AA基因型者，与以往的CHD传统危险因素研究相似，本研究也显示高LDL-C、低HDL-C均为早发CHD的独立危险因素。另外，冠脉三支病变组的G等位基因频率高于对照组（P＜0.05），也提示该等位基因与早发冠脉三支病变有关。

本研究显示CD36 rs3211956和rs7755的SNP与早发CHD有关，但其相关机制尚不清楚，推断可能与该两位点SNP影响BMI及HDL-C的水平有关。BMI值每升高1％，CHD的患病风险在女性提高3.3％，在男性提高3.6％[18]。同时，低HDL-C是 CHD的独立危险因素[19]。因此，CD36 rs3211956和rs7755的SNP可能通过影响BMI及HDL-C的代谢而影响冠脉粥样硬化的发生和发展。

本研究发现CD36的SNP与CHD的发生有关，但其对CD36功能的影响目前尚不清楚。今后将进一步扩大样本，并增加对CD36其他位点SNP的研究，为早发冠心病的发现和治疗提供更多理论依据。

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（2014-05-12收稿 2014-08-18修回）

（本文编辑 李鹏）

The Association of CD36 rs7755 and rs3211956 Single Nucleotide Polymorphism with Premature Coronary Heart Disease

ZHAO Weiwei,CHE Jingjin△,ZHANG Yanyan,SHAO Yuanxia,WANG Junqian
The Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China
△

E-mail：jingjinche@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the risk factors of premature atherosclerotic three-vessel coronary artery disease(CHD),and the association between single nucleotide polymorphism(SNP)of CD36 rs3211956,rs7755 and premature CHD.MethodsPatient with premature three-vessel coronary artery disease(n=102)which were confirmed by consecutive coronary angiogram(lesion group)and patients(n=72)without CHD(control group)were enrolled in the study.Conventional CHD risk factors were compared between the two groups as well as SNPs of CD36 rs3211956 and rs7755 to disclose independent risk factor for CHD,which were measured by mass spectrometry.ResultsAmong the conventional CHD risk factors,male,HBP,high LDL-C,low HDL-C were independent risk factors of premature CHD.The GT genotype proportion of rs3211956 was significantly lower(χ2=8.042，P=0.005)in the lesion group than that in control group while the TT genotype proportion is significantly higher in lesion group compared with that in control group(χ2=6.191，P=0.014).Patients with the TT genotype have higher score of BMI than patients with GG or GT genotype(P=0.037).The G allele proportion of rs7755 in the lesion group was significantly higher than control group(χ2=3.636,P=0.047).Patients of the GG genotype have higher scores of BMI but lower level of HDL-C than those with AA or AG genotype(P＜0.001).Logistic regression analysis revealed that after excluding a number of confounding factors,GG and TT genotype of rs3211956 and GG and GA genotype of rs7755 were respectively one of the independent risk factors for premature CHD.ConclusionThe SNPs of CD36 rs7755 and rs3211956 may be the independent risk factors of premature coronary heart disease and might affect the the onset of CHD by affectting BMI and HDL-C.

coronary heart disease；polymorphism,single nucleotide；antigens,CD36；risk factors；rs3211956；rs7755

R541.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.013

天津医科大学第二医院心脏科（邮编300211）△

E-mail：jingjinche@aliyun.com