融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究

李 圃 李冬田 尹冰楠 汤 华 尹利荣

融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究

李 圃①②李冬田③尹冰楠③汤 华③尹利荣②

目的：构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒，体外观察其对人卵巢癌细胞的直接抑制作用及其对血管内皮细胞生长的抑制作用。方法：用细菌内同源重组方法构建腺病毒穿梭质粒prAdCDglyES。采用脂质体介导转染293包装细胞，扩增获取重组腺病毒rAdCDglyES。采用MTT法观察rAdCDglyES对卵巢癌细胞SKOV-3生长抑制的影响，同时观察其表达产物抑制脐静脉血管内皮细胞ECV-304增殖的作用。结果：纯化的rAdCDglyES滴度是1×1013.3TCID50/L，其对SKOV-3细胞生长抑制率是（83.1±6.3）%，与对照组rAd-LacZ（24.1±13.2）%相比有显著性差异（P＜0.01）。浓缩的转染rAdCDglyES的细胞培养上清液抑制ECV-304细胞增殖，抑制率是（78.7±1.6）%，而同样浓缩的转染rAd-CD的细胞培养上清液抑制率是（23.9±9.7）%，二者有显著性差异（P＜0.01）。结论：研究结果表明重组腺病毒rAdCDglyES具有体外直接和间接抑制人卵巢癌细胞效能。

人卵巢癌细胞 胞嘧啶脱氨酶基因 内皮抑素 重组腺病毒 基因治疗

1Department of Gynecologic Oncology,Tianjin Central Hospital of Gynecology and Obstetrics,Tianjin 300100;2Department of

gynaecology and obstetrics,The 2nd Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,3Department of Microbiology,Tian

jin Medical University,Tianjin 300070,China.

This work was supported by the funds of Tianjin Municipal Natural Science Research Program(No.013615811).

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌和子宫体癌而列居第三位，但其死亡率却居妇科恶性肿瘤之首［1］。2008年每年新发病例高达22.6万例，病死人数14万人［2］。卵巢癌组织学类型多，缺乏有效的早期诊断方法，80%卵巢癌患者在晚期出现典型症状和确诊，且手术和放化疗疗效不佳，卵巢癌患者的初诊后5年生存率仅为30%，再加上卵巢癌复发性和耐药问题，严重威胁患者生命［3-4］。因此，寻找新的治疗方法迫在眉睫。

随着免疫学、分子生物学及基因工程技术的飞跃发展，诞生了生物疗法。生物疗法为癌症的治疗提供了一个新途径。恶性肿瘤的基因治疗即是将表达产物有治疗作用的外源性基因导入人体，最终达到直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞的目的。重组腺病毒是临床应用最为广泛的基因治疗载体，目前有少量方案进入Ⅲ期临床试验［5-6］。胞嘧啶脱氨酶（cytidine deaminase，CD）基因产物胞嘧啶脱氨酶可将无细胞毒性的抗真菌药物氟胞嘧啶5-FC转化为氟尿嘧啶5-FU，通过细胞毒性作用杀死肿瘤细胞［7］。内皮抑素（endostadine，ES）基因的产物内皮抑素能抑制内皮细胞增生、转移和新血管的生成，这些对肿瘤的生长、浸润和转移有重要意义［8］。本研究首先构建了含CD和ES的融合基因的重组腺病毒。该重组体能表达胞嘧啶脱氨酶，可将无细胞毒性的药物前体转化为具有细胞毒性的化疗药直接杀伤瘤细胞；同时表达内皮抑素，通过抑制肿瘤新生血管内皮细胞阻止瘤组织新生血管形成，使瘤组织缺血、缺氧，导致瘤细胞死亡，并阻断肿瘤转移灶的形成。进一步观察该重组腺病毒对人卵巢癌基因治疗的体外实验研究，结果论述如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒及菌株：重组质粒pAdE1CMV-CD（含CD基因）、质粒pEZZ18-ES（含ES基因）本室构建；本室保存DH5α细胞；pAdTrack-CMV（腺病毒载体穿梭质粒）、pAdEasy-1（腺病毒骨架质粒）、宿主菌BJ5183、DH10B购自Bert Vogelstein公司。细胞系为本室保存293细胞和人卵巢癌细胞株SKOV-3；人脐静脉血管内皮细胞ECV-304是由中国医学科学院血液病研究所提供。限制性内切酶：XbaⅠ、HindⅢ、BglⅠ、PacⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、PmeⅠ均购自美国NEB公司；Taq E购自美国Promega公司。CD上游引物为：5'-GAAG ATCTAGGCT AGCAATGTCGAATAACGCT-3'；下游引物为：5'-CCC AAGCTTGGGGGTACCTCCACGTTTGT AATCGAT-3'；ES上游引物为：5'-CGGGGTACCGG AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATTTATG CACAGCCACCGCGACTT-3'；下游引物为：5'-GCTCT AGATCACTTGGAGGCAGTCAT-3'。

1.2 方法

1.2.1 含CD基因穿梭质粒的构建和鉴定 扩增CD基因：以pAdE1CMV-CD为模板，用CD上、下游引物常规方法扩增；纯化CD基因：采用PCR纯化试剂盒（Clonetech，USA）推荐方法，备用；小量制备腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV：按《分子克隆》所述方法，-20℃保存；构建成穿梭质粒pAdTrackCMV-CD并鉴定：BglⅡ和HindⅢ酶切后的pAdTrack-CMV与CD按1∶3分子比混合，16℃连接30min，构建穿梭质粒后转化DH5α细胞。BglⅡ和HindⅢ双酶切后电泳，PCR方法鉴定。

1.2.2 含CDglyES融合基因穿梭质粒的构建和鉴定 PCR扩增ES基因：以pEZZ18-ES质粒为模板，用glyES上游和下游引物常规扩增ES基因；构建并鉴定pAdTrackCMV-CDglyES：经BglⅡ和XbaⅠ双酶切后连接pAdTrackCMV-CD和glyES，方法同前；用CD上游引物和glyES下游引物进行PCR扩增CDglyES，观察1.9 kb大小特异条带，BglⅡ和XbaⅠ双酶切pAdTrackCMV-CdglyES后电泳，观察9.2 kb和1.9 kb特异性条带鉴定pAdTrackCMV-CDglyES。

1.2.3 重组腺病毒rAdCDglyES的构建 1）细菌内同源重组prAdCDglyES质粒及鉴定 用PmeⅠ酶将pAdTrackCMV-CDglyES 1 μg切成线性，乙醇沉淀干燥后溶于6 μL灭菌双蒸水中。与0.1 μg pAdEasy-1质粒混合后转入电转杯中。加入12 μL感受态菌BJ5183，于Bio-Rad gene pulser中完成电穿孔，条件是2 500 V，200 ohms，25 μF。立即取出穿孔的细胞放入备好的500 μL LB中，120rpm 37℃水浴摇床缓慢摇动30 min，将200 μL涂于Kana+LB平板，37℃过夜。挑取较小菌落常规方法提取质粒DNA，PCR和PacⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定。酶切后纯化CDglyES基因片段进行测序确认。2）脂质体介导转染293细胞扩增rAdCDglyES 转染前24 h，6孔板中接种293细胞1×108/L，待融合成片约70%时，弃去营养液，DMEM洗1次，加入适量DMEM培养液，CO2孵箱中培养待用。备好PacⅠ酶消化成线性的rAdCDglyES，乙醇沉淀干燥，溶于6 μL灭菌蒸馏水中，将DMEM 500 μL和脂质体20 μL制备为转染混合液，置室温30 min。将293细胞中的DMEM弃去，加入转染混合液和2.5 mL DMEM，CO2孵箱培养4 h后换营养液继续培养，观察绿色荧光蛋白质（green fluorescence，GFP）表达监控细胞转染情况。293细胞发生病变、部分脱落时收获病毒，冻融3次取上清液3 mL，再感染293细胞，连续传代扩增重组病毒至第10代。

1.2.4 重组腺病毒纯化和滴度测定 96孔板中接种293细胞，培养成单层细胞，用培养维持液把rAdCDglyES病毒液稀释为10-1至10-11，每孔0.1 mL，每个浓度4个复孔，37℃、5%CO2培养7 d，每天观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）情况。依据Reed-Muench公式计算其滴度。

重组腺病毒培养上清液6 000 rpm 4℃离心10 min，每8 mL病毒上清液加4.4 g CsCl充分混合，再加入SW-41转子用的12 mL离心管中。指甲油2 mL覆盖后32 000 rpm 20 h 10℃超离。收集并合并所有收集的病毒液，透析后与等体积的2×贮存缓冲液混合，保存于-20℃。

1.2.5 肿瘤细胞抑制实验 用0.02%EDTA消化液将生长良好的肿瘤细胞SKOV-3消化为单个细胞，将细胞用1640营养液稀释为1×108个细胞/L，接种于96孔板中，第1列加0.1 mL营养液，而其余各孔加细胞液0.1 mL，37℃5%CO2培养为单层细胞。吸弃上清，将空白对照（第1列）和细胞对照（第2列）加入营养液，自第3列后依次加入rAd-lacZ，rAd-CD和rAd-CDglyES重组腺病毒各3列，均用营养液稀释为1010TCID50/L，0.1 mL/孔，37℃5%CO2培养12 h。弃病毒液，RPMI1640液洗2次，加入新鲜营养液继续培养12 h。吸弃上清并分别加入0和2 g/L 5-氟胞嘧啶（5-FC），0.1 mL/孔，37℃5%CO2培养48 h。每孔加10 μL MTT溶液，振荡混匀10 min。自动酶标仪检测A490吸光值。根据下列公式计算rAd/5-Fc对肿瘤细胞的生长抑制率：

1.2.6 血管内皮细胞抑制试验 用0.02%EDTA消化生长良好的ECV-304细胞为单个细胞，用1640培养液（含有ECGF 5 mg/L）稀释成2×108细胞/L，接种于96孔板。第1列加培养液，其余各孔加细胞液0.2 mL，37℃5%CO2培养为单层。吸弃液体，空白对照（第1列）和细胞对照（第2列）加培养液，自第3列后分别加入上述培养液稀释为25%的rAd-CD和rAd-CDglyES细胞培养上清液的浓缩液及后者的未浓缩液，各接种3列，每孔0.2mL，37℃5%CO2培养68 h。每孔加20 μL MTT溶液，继续培养4 h。吸弃液体，每孔加DMSO 200 μL，振荡混匀10 min。自动酶标仪测A570吸光值。依据下列公式计算细胞生长抑制率：

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 酶切鉴定构建的pAdTrackCMV-CD质粒

经双酶切后电泳可见特异性条带9.2 kb和1.3 kb（图1），证实CD基因的正确插入。

2.2 双酶切鉴定构建的质粒pAdTrackCMV-CDglyES

经双酶切后电泳可见特异性条带9.2 kb和1.9 kb（图2），1.9 kb符合CDglyES大小，证实ES基因的正确插入。

2.3 PCR鉴定同源重组的prAdCDglyES

分别用CD上游引物和ES下游引物、CD上下游引物及ES上下游引物进行PCR扩增，获取3条特异条带1.9 kb、1.3 kb和0.58 kb（图3）。证实成功同源重组。

2.4 计算重组腺病毒rAdCDglyES的滴度

293细胞上清液中rAdCDglyES的滴度是1×1010TCID50/L；纯化后 rAdCDglyES的滴度是 1×1013.3TCID50/L。

2.5 重组腺病毒rAdCDglyES／5-FC系统对SKOV-3细胞生长的抑制作用。

经rAdCDglyES/5-FC系统处理的正常SKOV-3细胞，可见细胞变圆，细胞病变明显；而未经rAdCDglyES/5-FC系统处理的正常SKOV-3细胞，细胞生长状态良好，呈典型“鹅卵石样”紧密排列（图4）。重组腺病毒报告基因GFP在SKOV-3细胞中表达，说明该病毒成功转染肿瘤；正常SKOV3细胞无GFP的表达（图5）。经方差分析，各组吸光度数值的差异有统计学意义（F=366.534，P＜0.01）。rAdCDgly-ES组与rAd-acZ组及rAd-CD比较均有显著性差异（P＜0.01）。3种重组病毒对瘤细胞SKOV-3均有一定程度的抑制作用，rAdCDglyES组对卵巢癌细胞SKOV-3的生长抑制率为83.1%，rAd-CD组和rAd-acZ组分别为70.6%和24.1%，rAdCDglyES组和rAd-CD组对肿瘤细胞抑制率均明显高于rAdLacZ组，且其差异均具显著性（P＜0.01）；比较rAdCDglyES与rAd-CD对肿瘤细胞的抑制也有显著性差异（P＜0.01，表1）。

图1 pAdTrackCMV-CD酶切电泳图Figure 1 pAdTrackCMV-CD restriction enzyme cutting electrophoresis

图2 pAdTrackCMV-CDglyES双酶切电泳图Figure 2 pAdTrackCMV-CDglyES restriction enzyme cutting electrophoresis

图3 PCR鉴定重组腺病毒prAdCDglyESFigure 3 Recombinant adenovirus prAdCDglyES identified via PCR

图4 rAdCDglyES/5-FC系统处理的SKOV-3细胞 （H&E×400）Figure 4 rAdCDglyES/5-FC processing SKOV-3 cell（H&E×400）

图5 SKOV-3细胞中重组腺病毒报告基因GFP的表达 （H&E×400）Figure 5 Expression of the recombinant adenovirus report gene GFP in SKOV-3 cell（H&E×400）

表1 rAd-LacZ、rAd-CD、及rAdCDglyES对SKOV-3细胞生长的抑制作用 （±s）%Table 1 Inhibition of rAd-LacZ,rAd-CD,and rAdCDglyES on proliferation of SKOV-3（±s）%

表1 rAd-LacZ、rAd-CD、及rAdCDglyES对SKOV-3细胞生长的抑制作用 （±s）%Table 1 Inhibition of rAd-LacZ,rAd-CD,and rAdCDglyES on proliferation of SKOV-3（±s）%

Groups n Cell inhibition rate（±s）% P 32 30 30 24.1±13.2* 70.6±5.8* 83.1±6.3* 0.01 rAd-acZ①rAd-CD②rAdCDglyES③①The culture supernatant from cells transfected rAd-acZ；②The culture supernatant from cells transfected rAdCD；③The culture supernatant from cells transfected rAdCDglyES（experiment group）；*P＜0.01

2.6 rAd-CDglyES细胞培养上清对内皮细胞ECV-304的影响

研究表明rAd-CD和rAdCDglyES 2种重组腺病毒表达产物不同程度地影响ECGF处理的ECV-304内皮细胞的增殖。经方差分析，各组吸光度值的差别有统计学意义（F=107.217，P＜0.01）。rAdCDglyES浓缩组与rAdCDglyES未浓缩组及rAd-CD浓缩组比较均有显著性差异（P＜0.01）。3种重组病毒对内皮细胞ECV-304均有一定程度的抑制作用，rAdCDgly-ES浓缩组对内皮细胞ECV-304的生长抑制率为78.7%，rAdCDglyES未浓缩组及rAd-CD浓缩组分别为27.8%和23.9%，rAdCDglyES浓缩组对ECV-304细胞的抑制率明显高于同样浓缩的rAd-CD组和未浓缩rAdCDglyES组，且其差异均具显著性（P＜0.01）；比较 rAdCDglyES未浓缩组与 rAd-CD浓缩组对ECV-304细胞的抑制无显著性差异（表2）。

表2 rAd-CD和rADCDglyES细胞培养上清对ECV-304细胞生长的抑制作用 （±s）%Table 2 Inhibition of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD and rAdCDg lyES on proliferation of ECV-304（±s）%

表2 rAd-CD和rADCDglyES细胞培养上清对ECV-304细胞生长的抑制作用 （±s）%Table 2 Inhibition of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD and rAdCDg lyES on proliferation of ECV-304（±s）%

Cell inhibition rate（±s）% Groups n P rAd-CD(concentrated)①rAdCDglyES②rAdCDglyES(concentrated)③①The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAd-CD（control group）；②The nonconcentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES；③The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES（experimental group）；*P＜0.01 10 10 10 23.9±9.7* 27.8±5.3* 78.7±1.6 0.01 0.01

3 讨论

自2000年基因治疗成功治疗遗传性疾病［9］至今，基因治疗已成为肿瘤治疗研究中一个重要方向。尽管肿瘤基因治疗在实验室内取得了很好的效果，部分已进入Ⅰ～Ⅲ期临床试验，但是应用于临床还有距离［6，10-11］。一些学者认为［5］其可能与以下因素相关：1）所有治疗方案中大多数只插入了单个目的基因；2）载体缺乏靶向性；3）载体转染效率、安全性和插入外源基因容量等问题。鉴于此，本研究构建了含CD和ES的融合基因重组腺病毒rAdCDglyES，并证实了CD和ES基因的正确切入。

本研究选用的载体是腺病毒5型（Ad5），目前腺病毒载体与肿瘤基因治疗临床实验所用载体的23.3%，其临床应用的可行性和安全性已获公认，生物学优势和临床应用优势突出［12］。较其他病毒载体相比腺病毒载体更易于培养及纯化、重组后其理化性质较为稳定，宿主范围广，载体容量大，转染率高，基因表达的能力强［10］，而且病毒DNA一般存在于细胞染色体外，整合突变致癌的可能性小。本研究选用了CD自杀基因做为融合基因之一，通过CD基因表达胞嘧啶脱氨酶使5-FC转变为5-FU直接杀伤瘤细胞［7］。CD基因已被开发用于基因治疗肿瘤［13-14］。O'Reilly等［8］报道内皮抑素可抑制内皮细胞生长迁移，并可抑制血管生成。在多种肿瘤中均可抑制其血管生成［14］，包括卵巢癌［15］。腺病毒载体可确保延长内皮抑素的表达［16］。本研究选用ES基因作为融合基因的另一基因。不同的肿瘤细胞对不同酶或前药体系的敏感性不同，肿瘤患者体内常同时存在多种克隆肿瘤细胞，采用单一酶或前药体系难以达到预想疗效，可采用联合多个基因的途径提高疗效。因此本研究将CD和ES基因融合插入腺病毒载体，构建直接、间接双重杀伤瘤细胞的重组腺病毒rAd-Cdgly-ES，观察其对肿瘤细胞的影响。

本研究将rAdCDglyES转染SKOV-3细胞，24 h细胞后无明显改变，荧光显微镜下可见大部分细胞呈绿色荧光，表明转染rAdCDglyES的瘤细胞中的重组腺病毒载体携带的GFP基因表达了绿色荧光蛋白，以此监察转染是否成功，比观察CPE早而方便。前药5-FC作用48h后可见病变的细胞。rAdCDglyES和rAd-CD分别转染卵巢癌细胞SKOV-3的生长抑制率与rAd-LacZ组比均有显著性差异，说明rAdCDglyES转染SKOV-3细胞后融合基因表达产物与rAd-CD一样表达胞嘧啶脱氨酶，使5-FC转化成5-FU对该细胞的生长有抑制作用。结果还显示rAdCDglyES表达产物也影响经ECGF处理的ECV-304细胞增殖。当rAdCDglyES表达产物10倍浓缩后其抑制率明显高于同样浓缩的rAd-CD表达产物抑制率，证实了rAdCDglyES中的ES基因活性未受影响，表达了内皮抑素，抑制ECGF处理后的内皮细胞的增殖。而未浓缩的rAdCDglyES表达产物对ECV-304细胞生长的抑制率与对照相比差异不显著，说明可能需要调整病毒的浓度才能保证对ECGF处理后的内皮细胞增殖发挥较强的抑制作用。

含CDglyES双基因的重组腺病毒是在国内外首次构建，并获得发明专利（证书号：第226769）。本研究通过体外试验证实了该重组体抑制人卵巢癌细胞（直接抑瘤作用）和血管内皮细胞的增殖（即对肿瘤的间接抑制作用）。后续将进一步深入研究rAdCDglyES体内外对人卵巢癌的影响，如体外继续摸索重组病毒和前药用量的合理配伍以达到最佳抑瘤作用、观察动物模型的体内抑瘤作用和病毒、药物配伍条件以及放、化疗的协同作用方面的研究等。

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（2013-12-11收稿）（2014-05-10修回）

（本文编辑：周晓颖）

Gene therapy of human ovarian carcinomain vitro

Pu LI1,2,Dongtian LI3,Bingnan YIN3,Hua TANG3,Lirong YIN2
Correspondence to:Lirong YIN;E-mail:yinLiRongfk@sina.com

Objective:To construct a recombinant adenovirus containing CDglyES fusion gene,which can directly inhibit human ovarian cancer cell and indirectly inhibit vascular endothelial cell growth.Methods:We constructed prAdCDglyES using a homologous recombination method in bacteria.The prAdCDglyES was transfected to 293 packaging cells using liposome,in which rAdCDgly-ES was packaged and amplified.MTT was used to observe the proliferation inhibition effect of rAdCDglyES on human ovarian cancer cells and the growth inhibition effect of expressing products of rAdCDglyES on ECV-304.Results:The titer of rAdCDglyES was 1× 1013.3TCID50/L,whereas the inhibition rate on human ovarian cancer cell SKOV-3 was(83.1±6.3)%.This result is significantly different from the control rAd-LacZ,which had an inhibition rate of(24.1±13.2)%(P＜0.01).The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES can inhibit ECV-304 cell proliferation at a rate of(78.7±1.6)%.This rate is significantly different compared with that of the control with the same concentration of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD,with an effect on ECV-304 cell shown by an inhibition rate of(23.9±9.7)%(P＜0.01).Conclusion:The results showed that the recombinant adenovirus rAdCDglyES could inhibit human ovarian cancer cells directly and indirectly.

human ovarian cancer,cytidine deaminase,endostadine,adenovirus,gene therapy

10.3969/j.issn.1000-8179.20140756

李圃 硕士研究生，主治医师。研究方向为妇科和妇科肿瘤。

①天津市中心妇产科医院肿瘤科（天津市300100）；②天津医科大学第二附属医院妇产科；③天津医科大学微生物学教研室

尹利荣 yinLiRongfk@sina.com

E-mail：2326791@qq.com