金龙胶囊抗脑肿瘤的系统生物学研究

黄 卉 曲育莹 王秋玲 岳贵娟 李 娜 李建生

·基础研究·

金龙胶囊抗脑肿瘤的系统生物学研究

黄 卉①②曲育莹①②王秋玲①②岳贵娟①②李 娜①②李建生①②

目的：利用系统生物学技术分析中药复方金龙胶囊抗脑肿瘤的分子机制。方法：取金龙胶囊组及空白对照组小鼠的原位脑肿瘤组织样本进行基因芯片检测，通过比对获取差异基因；使用一步过连通测算和多步骤隐藏节点测算获得拓扑基因；采用富集分析法分析其生物功能；借助MetaCore平台构建分子机制网络图。结果：与对照组相比，金龙胶囊组共有37个差异基因（倍数＞2），106个拓扑基因。金龙胶囊的靶点主要集中在细胞粘附和凋亡、免疫应答、神经组织发育等。结论：金龙胶囊通过诱导神经细胞特有基因表达和抑制干扰素信号转导发挥抗脑肿瘤作用。

金龙胶囊 基因芯片 系统生物学 脑肿瘤 机制

中药成分复杂，作用整体性强，具有多靶点、多环节、多通路的特点，其药效发生机制一直是研究者长期从事的热点课题之一。

金龙胶囊是由守宫、金钱白花蛇和蕲蛇组成用于血瘀郁结型肿瘤的治疗，也可用于晚期癌症的姑息治疗。动物实验结果表明，金龙胶囊具有较好的抑制原位脑肿瘤动物模型中颅内肿瘤生长的作用［1］，但其药理机制尚不清楚。本研究选取金龙胶囊干预后颅内肿瘤组织，实验组为金龙胶囊给药组，对照组为给予溶媒的空白组，进行基因芯片检测，采用系统生物学方法［2］对基因组学结果进行分析，最终获取金龙胶囊抗脑肿瘤的分子作用机制，为中药药理机制研究方法提供新的途径和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

金龙胶囊（北京建生药业有限公司）批号为100945；5～6周龄雌性裸鼠，合格证号：SCXK京2009-0004（北京华阜康生物技术股份有限公司）；Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片（美国Affymetrix公司）；MetaCore系统生物学分析平台（汤森路透科技集团）。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片检测 应用外科原位移植方法［3］，建立裸鼠原位脑肿瘤动物模型。将裸鼠随机分为对照组（给予溶媒）和金龙胶囊组，连续灌胃给药28 d后处死动物，取颅内肿瘤组织，提取总RNA，使用RT-PCR方法反转录合成cDNA，体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA的纯化。cRNA经片段化处理后，与Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片杂交。杂交16 h后取出芯片，在Affymetrix公司的专用设备Affymetrix Fluidids Station 450中完成清洗和染色。使用Affymetrix公司的GeneChip Scanner 3000扫描仪对杂交信号进行扫描，获取基因表达的荧光信号强度。扫描图像采用Affymetrix GenChip Command Console Software（AGCC）软件进行数字化处理，取得金龙胶囊药物干预后的差异基因表达谱。

1.2.2 数据前处理 运用多陈列对数健壮算法（RMA）对上述取得的基因表达原始数据信息进行归一化处理［4］，并采用最新版本的探针注释系统，使每1个探针都能对应1个独立的基因。通过这些前处理，将会获得1个非冗基因标准化信号表达的数据集，此数据集中分别包含了2个样本的基因表达信息。将金龙胶囊药物干预组样品基因表达信息与空白对照组样品基因表达信息进行比对，取得差异基因表达谱，同时计算每个差异表达基因的差异倍数。

1.2.3 拓扑基因的获取 为了将在分析差异基因的过程中被忽视但实际上有可能是药物发挥调控作用的靶点基因挖掘出来，采用了2种网络拓扑评分算法（一步过连通测算和多步骤的隐藏节点测算），从而挖掘对差异基因直接发挥调控作用的因子和间接发挥调控作用的重要远端因子，“拓扑重要基因”（topologically significant genes）。1）一步过连通测算［5-6］，采用以下公式：

其中N为GeneGo数据库（GeneGo Global NetworkTM）中的蛋白总数；R为输入文件中的基因总数；n为与输入文件中某特定基因连通的连通总数；r为与输入文件中某特定基因有一步连通性的化合物的总数。对差异基因与数据库中的各化合物连通水平的高低进行分析，并评价其统计学显著性水平，旨在寻找与差异基因有一步连通性的重要调控因子。2）多步骤隐藏节点分析：采用了拓扑评分测算方法［7-8］，将差异基因整合入一个网络，来构建这些基因之间通过最短路径互相连通的网络图，同时计算出在这个最短路径网络图中穿过某基因的路径数量以及在GeneGo Global NetworkTM数据库中穿过此基因的路径数量。根据这些路径数目以及与之相对应的原始数据，评估某基因通过多步骤与输入文件中特定基因相连通的统计学显著性。统计学显著性高的节点被认为是拓扑重要节点。

1.2.4 通路及生物学功能分析 采用富集分析的方法来探讨差异基因和拓扑基因的各项生物功能。其中GeneGo数据库中的功能分析项目为：1）范式通路；2）生物学过程网络；3）疾病表面标志物；4）毒理网络；公共数据库中的功能分析为：1）生物学过程；2）分子功能；3）细胞定位，每个项目的富集程度用以下公式进行计算：

其中N为检测所用的基因芯片上的基因总数；R为差异基因和拓扑基因总数；n为某方面中具体某一个条目中所包含的基因总数；r为某方面中具体某一个条目中所包含的差异基因和拓扑基因总数。

1.2.5 机制网络图构建 以细胞或组织的特定响应为依据，将以上对差异基因、拓扑基因、通路和生物学功能的分析内容进行整合，借助使用MetaCore平台上的人工注释系统（蛋白、蛋白间相互作用关系、通路）、运算工具包和滤器构建一个涵盖疾病、毒理、药物响应、分子过程等信息的可视化模型，即药物机制网络图。机制网络图的构建主要涉及以下2个方面：1）对多个信号通路综合进行构建，来揭示组织或细胞对药物的特定响应是如何产生的；2）将与产生这种特定响应相关的关键条目整合入通路中，来构建一个系统的机制模型图。

2 结果

2.1 差异基因

利用GeneGo数据库对芯片检测得到的原始数据进行分析，获得金龙胶囊作用后的差异基因表达谱。结果显示，0.75 g/kg金龙胶囊组与模型组相比，差异倍数上调2倍以上的差异表达基因前10个（表1），差异倍数下调2倍以上的差异表达基因前15个（表2）。

2.2 拓扑基因

2.2.1 一步过连通拓扑基因 通过一步过连通测算，共获得9个一步过连通拓扑基因（表3），其中基质金属蛋白酶家族成员（MMP-2、Stromelysin-2、MMP-25、Stromelysin-1）对生理、病理过程以及肿瘤发生发展过程中的细胞外基质降解即发挥重要作用［9］，另外还包括与肿瘤相关的基因GlyT1、Sno-N、TXNDC5、AP-1以及Plasmin。

2.2.2 多步骤拓扑基因 拓扑评分测算分析得到作为细胞粘附分子家族的成员之一整合素（alpha-2/beta-1 integrin、ITGA2、ITGB1）扮演着介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互粘附的角色，对肿瘤的发生、发展和转移起关键调控作用［10］；得到了对神经元存活、生长和功能有重要影响并与肺癌细胞的增殖活动相关的脑源性神经营养因子（BDNF）［11］；以及正黏蛋白MUC1和与肿瘤的浸润转移相关的基因Stromelysin1等97个多步骤拓扑基因。

2.3 通路及生物学功能分析

将差异基因在7个项目中分别进行富集分析，选取显著性高的条目（P＜0.05）；将拓扑基因在7个项目中分别进行富集分析，选取显著性高的条目（P＜0.05）；选取上述结果中对差异基因和拓扑基因显著性都高的条目（P＜0.05）；将差异基因和拓扑基因整合在一起对7个项目的每项分别进行富集分析，选取显著性高的条目（P＜0.05），最终得到6条范式通路和4个关键生物学网络（表3）。

2.4 机制网路图的构建

金龙胶囊组与对照组比对分析构建机制网络图（图1），对这一网络图进行简化处理（图2）可见，金龙胶囊能诱导神经细胞特有基因的表达，抑制干扰素信号传导。IFI17（IFIM1）、IFITM2、SERPINA3（ACT）与免疫和炎症应答相关，而免疫应答在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色，其中IFI17可通过抑制细胞外信号调节激酶（ERK）的激活以及将细胞周期阻滞在G1期而在IFN-γ抗细胞增殖过程中起到关键作用［12］。

表1 差异2倍以上的上调基因列表Table 1 Genes upregulated for more than twofold

表2 差异2倍以上的下调基因列表Table 2 Genes downregulated for more than twofold

表3 关键范式通路图（6个）和关键生物学网络（4个）列表Table 3 Key pathways and process networks

▶1.Differential gene；2、3.Hidden nodes图1 金龙胶囊组与对照组比对后构建的机制网络图Figure 1 Comparison of the network diagram mechanism of the Jinlong capsule group and the control group

▶1.Differential gene；2、3.hidden nodes图2 金龙胶囊的机制网络简化图Figure 2 A simplified diagram of mechanism of Jinlong capsule

3 讨论

系统生物学在医药领域的应用较为广泛，为多环节药物作用机制的研究提供了有力手段。目前抗肿瘤药物的研究已从传统的细胞毒性向多环节作用机制的新型药物方向发展。中药的作用机制较为复杂，因此如何利用新型技术发掘抗肿瘤药物的分子作用机制成为焦点。应用系统生物学技术分析复方中药金龙胶囊作用前后mRNA表达水平的改变，从分子水平了解中药的多作用靶点、方式及代谢途径，并进一步了解其作用机制。

机制网络图的构建是整个机制分析中非常重要的一环。在生物医学领域，构建机制网络图的方法差别较大［13］，但大体上均是以细胞或组织的特定响应为依据，将之前的分析内容进行整合，构建一个网络图［14-15］。本研究借助MetaCore平台上的人工注释系统（蛋白、蛋白间相互作用关系、通路），同时也基于真核生物的信号通路来完成。为了探究核心的信号通路，本研究也纳入了一部分不在关键通路里但是功能明确的效应基因群，使核心通路发挥功能效应的来龙去脉更加明晰，也使得整个功能模型更加完整。因此，整个构建机制网络图的分析过程是以关键通路图为基础，作为搭建的主要框架。由于GeneGo范式通路图是以实验验证为基础而搭建的一个数据库平台，因此为机制网络图的构建提供了更高的可信度。

本研究肯定了金龙胶囊对小鼠脑肿瘤的治疗作用，通过使用基因组学及系统生物学分析方法，获得了金龙胶囊干预后脑肿瘤组织的差异基因表达谱，并通过分析测算得到了与之相关联的发挥调控作用的隐藏节点（即拓扑基因），通过对其生物功能的分析发现，这些基因的生物功能主要集中在细胞黏附和凋亡、免疫应答、神经组织的发育等方面。基于对差异基因、拓扑基因以及其生物功能的富集分析，本研究构建出金龙胶囊发挥抗脑肿瘤作用的机制网络图，将金龙胶囊的作用靶点、通路以及这些靶点通路之间的关系以网络图的形式展现出来，充分体现了网络药理学的研究理念，也显示出系统生物学分析方法的可行性和优势。该网络图显示，金龙胶囊可以刺激神经递质的释放及相关信号，促进神经元的分化，调节神经细胞骨架的重构。这种行为提示，受金龙胶囊抗脑肿瘤作用的影响，一部分脑肿瘤细胞可能会分化为神经细胞。金龙胶囊的另一个重要作用机制是下调干扰素相关信号，这些与免疫应答和抗炎反应关系密切。由于炎症在癌症的发生发展中扮演重要角色，金龙胶囊对干扰素相关信号的下调作用应当是其发挥抗肿瘤作用的重要方面。当然，这种预测性的分析结果还需要一系列实验来进行验证，但其对后续实验的设计和开展具有极其重要的指导意义，为机理的深入阐释奠定了基础。

1 Huang H,Cui XW,Yue GJ,et al.Treatment of gliomatosis cerbri growth with Jinlong Capsules[J].Chinese traditional patent medicine,2013,35(9)：39.［黄 卉,崔向微,岳贵娟,等.金龙胶囊治疗脑肿瘤药理机制研究[J].中成药,2013,35(9)：39.］

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（2014-02-20收稿）

（2014-04-24修回）

（本文编辑：杨红欣）

Study of anti-cancer traditional Chinese medicine using systems biology technology

Hui HUANG1,2,Yuying QU1,2,Qiuling WANG1,2,Guijuan YUE1,2,Na LI1,2,Jiansheng LI1,2
Correspondence to:Jiansheng LI;E-mail:lyz988@gmail.com

1Beijing Vital Medicine Research&Development Centre,Beijing 100039;2Beijing Jiansheng Pharmaceutical Co.Ltd,Beijing

100039,China.

Objective:This article focuses on the research of molecular mechanism of brain tumor treatment using the Jinlong capsule via system biology technology.Methods:Human Genome U133 Plus 2.0 gene chip was used to detect the genes of samples,including the brain tumor tissues of nude mice after Jinlong capsule intervention and those of blank control group mice.Differentially expressed genes were identified based on fold change between the two groups.To identify the upstream regulators of the response signatures,the differentially expressed genes were subjected to interactome analysis by one-step overconnectivity test and multi-step hidden node algorithm.A set of genes preferentially connected to differentially expressed genes via direct interactions and pathways(called topologically significant genes)was generated.Concurrent pathway enrichment analysis on key pathways,processes,and functional units of both differentially expressed genes and topologically significant genes was performed to identify the most likely signaling pathways connecting regulators and effector genes.Finally,condition-specific networks(called causal network)were built to model molecular events by using a set of manually annotated protein interactions,pathways,and proteins and a toolkit of algorithms and filters on Meta-Core platform.Results:A total of 37 differentially expressed genes have been identified between Jinlong capsule-treated sample and vehicle sample with fold change of 2.Connection analysis identified 106 topologically significant genes.The main feature of the causal network is stimulation of neural cell specific genes that regulate normal cell physiology,particularly developmental processes and apoptosis.Another important effect of the Jinlong capsule is its inhibition of the gene markers of interferon response,suggesting signaling inhibition,followed by de-activation of immune response.Conclusion:Jinlong capsule exerts an anti-neoplastic effect by inducing stimulation of neural cell and by inhibiting interferon signal transduction.

Jinlong capsules,gene chip,systems biology,brain tumor,mechanism

10.3969/j.issn.1000-8179.20140305

黄卉 博士，副研究员。研究方向为肿瘤药理学，包括重组蛋白表达、未知基因功能预测等。

①北京鲜动物药研制中心（北京市100039）；②北京建生药业有限公司

李建生 qiuling0915@163.com

E-mail：huanghui_phd@yeah.net