乳腺癌中BAG-1 EGFR和PARP-1的表达及其临床意义

王荣荣 刘 晓 陆 苏 顾 林 向 荣 刘 红

·临床研究与应用·

乳腺癌中BAG-1 EGFR和PARP-1的表达及其临床意义

王荣荣①刘 晓①陆 苏①顾 林①向 荣②刘 红①

目的：观察乳腺癌组织芯片中BAG-1、EGFR和PARP-1的表达及其与临床病理指标的相关性，并探讨其临床意义。方法：采用免疫组织化学法对159例组织芯片中乳腺癌和癌旁组织点行BAG-l、EGFR及PARP-1蛋白检测，同时分析其与临床病理指标的相关性。结果：乳腺癌组织中BAG-1、EGFR、PARP-1蛋白表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。BAG-1蛋白表达水平与年龄、肿瘤部位、淋巴结转移数目、临床分期均无明显相关性，但与肿瘤大小、组织学分级、ER、PR和HER-2表达以及分子分型有关（P＜0.05）；EGFR蛋白表达水平与肿瘤大小、临床分期以及分子分型有明显相关性（P＜0.05）；PARP-1与组织学分级、淋巴结转移数目、ER表达以及分子分型有关（P＜0.05）。119例病例中BAG-1蛋白表达与EGFR、PARP-1蛋白表达无明显相关性，但在三阴性乳腺癌（TNBC）中BAG-1蛋白表达与PARP-1蛋白表达呈正相关（P＜0.05）。单因素分析结果显示，BAG-1、PARP-1蛋白表达和分子分型是影响乳腺癌患者预后的因素。多因素分析结果显示，BAG-1、PARP-1蛋白表达是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。结论：乳腺癌中BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白高表达提示其可能参与乳腺癌的发生发展，BAG-1、EGFR和PARP-1高表达可作为乳腺癌诊治和预后的生物指标。

乳腺癌 免疫组织化学 BAG-1 表皮生长因子受体 聚ADP核糖聚合酶-1

1Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Can

cer Prevention and Therapy,Tianjin,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Min

istry of Education,Tianjin 300060;2Nankai University Medical School,Tianjin 300071,China.

乳腺癌是严重威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一。近年来随着对乳腺癌基础与临床研究的不断深入，乳腺癌发病机制及治疗的研究取得重大进展［1］，但影响乳腺癌治疗及预后的相关因素及这些因素的关系仍不明确，尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）。TNBC作为一种恶性程度高，预后较差的一类特殊乳腺癌，目前尚无针对其有效的药物，缺乏药物有效靶点［2］。研究表明Bcl-2结合抗凋亡基因-1（Bcl-2 associated athanogene-1，BAG-1）是一种可与多个靶点相互作用的多功能蛋白，在多种肿瘤中呈高表达状态［3］。表皮生长因子受体（EGFR）属于受体酪氨酸激酶家族之一，其过度表达可能与肿瘤转移和预后有关，聚ADP核糖聚合酶-l（poly ADP-ribose polymerase-l，PARP-1）表达上调可能与乳腺癌的发生、发展和预后有关。但乳腺癌中BAG-1表达与EGFR和PARP-1表达关系及临床意义尚不清楚。本研究采用免疫组织化学法对乳腺癌组织中BAG-1、EGFR和PARP-1进行检测，并结合临床病理资料探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 乳腺癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。每张芯片含159例乳腺组织点，包括119例乳腺癌组织和40例癌旁组织（个别组织点在实验过程中脱片）。患者均为女性，中位年龄为50（29～83）岁，病理类型均为浸润性导管癌，随访中位时间为110（2～131）个月。本研究经本院伦理委员会审查批准。

1.1.2 试剂 兔抗人BAG-1抗体购自美国Abcam公司，兔抗人EGFR、PARP-1抗体购自美国CST公司。工作浓度均为1：100。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 采用免疫组织化学法检测BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白表达。主要步骤如下：组织芯片常规脱蜡至水后微波修复抗原，3%过氧化氢洗脱10 min，5%正常山羊血清室温封闭组织1 h。分别滴加兔抗人BAG-1、EGFR和PARP-1单克隆抗体，5%正常山羊血清稀释（1∶100）抗体，4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的二抗，5%正常山羊血清稀释（1∶200）抗体，室温孵育组织2 h，HRP-生物素偶联的三抗室温孵育1 h。上述各步骤结束后均以PBS震荡洗涤3次、各5 min，DAB显色5 min，苏木精复染、脱水透明、中性树胶封固。阴性对照为PBS替代一抗和正常兔血清替代一抗的空白对照，以已知阳性的乳腺癌标本为阳性对照。

1.2.2 结果判定 由两位具备高级职称的乳腺病理学专家进行双盲阅片，一致率达95%以上。根据染色强度和染色面积对组织点染色进行分级。染色强度判定标准：无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分，共4个级别；染色面积判定标准：每个组织点光镜（×400）下随机观察5个视野，每个视野观察100个细胞，计数阳性细胞百分比。BAG-1阳性细胞＜1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，＞80%为4分；EGFR阳性细胞＜1%为0分，1%～10%为1分，11%～30%为2分，＞30%为3分；PARP-1阳性细胞＜1%为0分，1%～5%为1分，6%～25%为2分，26%～50%为3分，＞50%为4分。染色强度和染色面积两者计分相乘即染色等级：分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性4个等级。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。阳性表达率比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关分析法。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验进行生存率的比较，采用Cox回归分析进行多因素分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的表达

BAG-1蛋白阳性产物主要定位于细胞质和细胞核，呈棕黄色颗粒（图1A）；EGFR蛋白阳性产物主要定位于细胞膜，呈线样结构，部分阳性细胞着色位于细胞质（图1B）；PARP-1蛋白阳性产物主要位于细胞核，也可见于细胞质（图1C）。119例乳腺癌组织中BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的表达率分别为95.80%（114/119）、31.09%（37/119）和57.14%（68/ 119），均明显高于40例癌旁组织（个别组织点脱片）的表达率73.53%（25/34）、13.51%（5/37）和22.86%（8/ 35）（均P＜0.05）。

▶A.BAG-1 expression；B.EGFR expression；C.PARP-1 expression图1 乳腺癌中组织BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的阳性表达（SP×400）Figure 1 BAG-1，EGFR，and PARP-1 expression in breast cancer（SP×400）

2.2 BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白表达与临床病理因素的关系

BAG-1蛋白的阳性表达与年龄、淋巴结转移数目、临床分期无显著相关性（P＞0.05），与肿瘤大小、组织学分级、ER、PR、HER-2表达以及分子分型相关（P＜0.05），肿瘤体积较大、组织学分级差、ER、PR阳性以及HER-2阴性的患者BAG-1阳性表达率较高；EGFR蛋白表达水平与肿瘤大小、临床分期以及分子分型具有显著相关性（P＜0.05）；PARP-1与组织学分级、淋巴结转移数目、ER表达以及分子分型相关（P＜0.05），见表1。EGFR和PARP-1在三阴性乳腺癌中的表达显著高于其他分子亚型中的表达（P＜0.05）。在三阴性乳腺癌中对BAG-1与EGFR和PARP-1的阳性表达进行Spearman相关分析，结果显示BAG-1阳性表达与EGFR阳性表达无显著相关性，而与PARP-1阳性表达呈正相关（P＜0.05）。

2.3 影响乳腺癌预后的单因素分析

单因素Kaplan-Meier分析结果显示，BAG-1、PARP-1表达以及分子分型是影响乳腺癌患者预后的相关因素（表2），BAG-1高表达（图2A）、PARP-1阳性表达（图2B）以及三阴性乳腺癌亚型（图3）的患者预后均较差。

2.4 影响乳腺癌患者预后的多因素分析

将单因素分析中影响乳腺癌患者预后的BAG-1、PARP-1表达状态以及分子分型引入Cox回归模型进行分析，结果表明BAG-1、PARP-1表达状态是影响乳腺癌患者预后的独立因素（表3）。

表1 BAG-1、EGFR和PARP-1表达与临床病理指标的关系 例（%）Table 1 Relationship of BAG-1，EGFR，and PARP-1 expression with clinico pathologic indicators n（%）

表2 影响乳腺癌患者预后的单因素分析Table 2 Correlation of various indicators with overall survival（OS）in breast cancer

图2 BAG-1、PARP-1不同表达组乳腺癌患者的OS生存曲线Figure 2 Kaplan-Meier curves for the OS of breast cancer according to BAG-1 and PARP-1 expressions

图3 三阴性或非三阴性乳腺癌患者的OS生存曲线Figure 3 Kaplan-Meier curves for the OS of breast cancer according to TNBC or non-TNBC

表3 影响乳腺癌患者预后的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of prognostic factors in breast cancer

3 讨论

近年来，乳腺癌的发病率呈持续上升趋势。在我国大部分地区，乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中已经跃居首位［4］，因此开展乳腺癌防治研究以控制乳腺癌的发生发展极为重要。乳腺癌的发生和发展涉及到多种癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的细胞生物学行为的改变，但是目前乳腺癌的发病机制仍不明确。因此进一步研究乳腺癌的发病机制并寻求早期诊断及防治措施成为焦点。BAG-1、EGFR和PARP-1三者在乳腺癌中的研究均有报道，三者对乳腺癌的发生发展具有促进作用，但三者共同在乳腺癌中的研究鲜见报道，因此探讨三者在乳腺癌发生发展中的作用，将会对乳腺癌的发生发展及防治产生重大意义。

BAG-1是Cutress等［5］在寻找抗凋亡Bcl-2蛋白和活化的糖皮质激素受体结合蛋白的相关研究时发现的另一种抗凋亡基因，其可以通过与大量的细胞靶点相互作用来实现其多功能的抗凋亡作用，而且通过作用于分子伴侣等多种蛋白分子调节细胞的增殖、转录、迁移和运动［6-7］。研究表明，BAG-1在乳腺癌中的阳性表达率较高，并且其表达与临床分期、组织学分级及预后密切相关［8-9］。但另有研究显示，BAG-1表达与组织学分级无相关性［10］。本研究发现，BAG-1在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，并且肿瘤体积越大分化水平越低，BAG-1的表达水平越高预后越差，这与文献［8-9］报道类似。另外，本研究发现ER、PR阳性以及HER-2阴性的患者，BAG-1阳性表达率较高。因此推测BAG-1的表达可评价乳腺癌患者的预后，并且与内分泌及靶向药物治疗的耐药相关。

众所周知，EGFR在乳腺癌的发生发展中扮演着重要的角色。研究表明［11-12］，EGFR在多种人类肿瘤中过表达，其过表达与肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关，在乳腺癌中EGFR和HER-2常共同表达（10%～36%），与预后不良相关。本研究发现，EGFR在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，其阳性表达与肿瘤大小、临床分期相关，并且EGFR蛋白在TNBC中的阳性表达率显著高于其他分子亚型，这与Rakha等［12］研究一致，说明EGFR可能促进肿瘤的发生发展，且可以作为TNBC的一个预后指标。

PARP-1是一类存在于多数真核细胞中具有重要生理功能的蛋白质翻译后修饰酶，在DNA损伤修复、DNA复制、细胞增殖分化调控、细胞凋亡及基因组的稳定方面发挥着重要作用。本研究发现PARP-1在乳腺癌中表达显著高于癌旁组织，且乳腺癌组织分化程度越差淋巴结转移数目越多，ER阳性表达患者其表达率越高，并且在TNBC中的表达高于非TNBC，推测PARP-1表达上调可能与乳腺癌的发生、发展和预后相关，并且可能成为TNBC的治疗靶点，这与文献［13-14］研究一致。

既往研究表明［15］，BAG-1作为细胞内分子伴侣，可以和多种生长因子受体结合，降低BAG-1表达以提高EGFR表达。推测BAG-1可能与EGFR结合，通过改变EGFR蛋白表达及稳定性影响其功能。本研究结果显示，BAG-1蛋白与EGFR蛋白表达无显著相关性，因此二者之间的相关性需进一步研究证实。BAG-1和PARP-1均为细胞凋亡途径中的关键分子，促进肿瘤的发生发展。本研究发现，在TNBC患者中BAG-1阳性表达与PARP-1阳性表达呈正相关，提示在TNBC中BAG-1与PARP-1共同参与其发生、发展及不良预后。另外，EGFR和PARP-1在TNBC中的表达均高于非TNBC，二者可能作为TNBC的治疗靶点，从而提高患者的生存期和生活质量。

总之，BAG-1、EGFR和PARP-1高表达状态可能与乳腺癌发生、发展以及预后有关，可能成为乳腺癌诊治及预后的生存指标。并且三者在TNBC中扮演着重要的角色，对于进一步寻找TNBC治疗有效靶点，提高TNBC患者的生存期和生活质量有重要意义。但是由于乳腺癌预后受多种因素影响，如手术方式、术后治疗等，这些因素在本研究中不易控制。因此关于影响乳腺癌预后的因素需要进一步行前瞻性的研究，BAG-1、EGFR和PARP-1三者在乳腺癌中的作用机制仍需更加深入的研究。

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（2014-01-15收稿）

（2014-05-11修回）

（本文编辑：张亻 刡）

BAG-1,EGFR,and PARP-1 expressions in breast cancer and their clinical significance

Rongrong WANG1,Xiao LIU1,Su LU1,Lin GU1,Rong XIANG2,Hong LIU1
Correspondence to:Hong LIU;E-mail:lh713@163.com

Objective:To observe BAG-1,EGFR,and PARP-1 expressions in invasive breast cancer and its correlation with clinical pathological indicators,as well as to evaluate their clinical significance.Methods:The BAG-l,EGFR,and PARP-1 expressions in a tissue microarray of invasive breast cancer and peritumoral tissues were detected through immunohistochemical staining.The clinical and pathological significance of BAG-1,EGFR,and PARP-1 were evaluated.Results:The BAG-1,EGFR,and PARP-1 expression levels are higher in invasive breast cancer tissues than in peritumoral tissues(P＜0.05).BAG-1 expression in invasive cancer tissues is not related to age,tumor site,lymph node metastases,and clinical TNM staging of patients,but is related to size,grade,ER,PR,and HER-2 expressions and molecular subtype(P＜0.05).EGFR expression is related to size,clinical TNM staging,and molecular subtype (P＜0.05).PARP-1 expression is related to grade,lymph node metastases,ER,and molecular subtype(P＜0.05).BAG-1 expression is not significantly correlated with EGFR and PARP-1 in all cases,but BAG-1 and PARP-1 expressions are positively correlated in triple-negative breast cancer tissues(P＜0.05).Results of the univariate analysis revealed that the BAG-1 and PARP-1 expressions and the molecular subtypes are associated with the prognoses of breast cancer patients.Multivariate analysis revealed that BAG-1 and PARP-1 expressions are factors that are independent of the prognosis.Conclusion:BAG-1,EGFR,and PARP-1 overexpressions in human breast tissues suggest that BAG-1,EGFR,and PARP-1 are related to breast cancer development.BAG-1,EGFR,and PARP-1 are potential biomarkers of breast cancer diagnosis and prognosis.

breast cancer,immunohistochemistry,BAG-1,epidermal growth factor receptor,poly(ADP-ribose)polymerase-l

10.3969/j.issn.1000-8179.20140116

王荣荣 硕士研究生。研究方向为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗。

①天津医科大学肿瘤医院乳腺二科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室（天津市300060）；②南开大学医学院

刘红 lh713@163.com

E-mail：jr_wang1213@126.com