利用梯度平板法结合紫外诱变、抗性筛选选育土霉素高产菌株

王小娟，张萍，逄春梅，石彦鹏

（宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101）

利用梯度平板法结合紫外诱变、抗性筛选选育土霉素高产菌株

王小娟，张萍，逄春梅，石彦鹏∗

（宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101）

以龟裂链霉素TMSⅠ12－66为出发菌株，通过紫外－氯化锂诱变处理，并结合梯度平板法、氯化锂和四环素复合抗性平板上筛选土霉素高产菌株。通过对致死率的考察，确定了紫外的最佳诱变剂量为90 s。在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入四环素进行正突变株的定向筛选。经过选育得到一株土霉素的高产菌株TMSⅠ14－180，摇瓶发酵验证效价达22985 mg／mL，较出发菌株提高22.36%，经传代试验考察，该菌株遗传性状稳定。

龟裂链霉菌；紫外诱变；抗性筛选

土霉素是一种四环素类广谱抗生素，抗菌谱广，在医疗和畜牧业上广泛应用。土霉素的产生菌龟裂链霉菌经过长期多次的常规诱变处理，其处理效果已不明显。常规诱变方法所产生的突变是随机的，虽然其突变频率高，但无方向性，导致目标菌株筛选工作量大，影响选育效率。链霉菌产抗生素能力与抗生素抗性基因之间的对应关系也是目前抗生素科研领域的一个研究热点［1－2］。抗性筛选是利用微生物对某些抗生素的耐药性，在菌种选育中对大量突变株进行有目的的筛选，有利于抗生素产量的提高［3］，从而高效地得到目的菌株。该筛选方法操作简单、周期短、安全性好［3－5］，能够直接影响微生物产抗生素的调控系统，从而使抗性筛选在抗生素高产菌的选育中得到广泛应用［4］。利用紫外线和氯化锂诱变的方法以及两种方法合用或与其他诱变方法合用已是筛选突变株的常用方法［6－7］。氮离子注入［8］、亚硫酸氢钠［9］和各种方法联用的复合诱变方法［10］也应用广泛，但各种方法都有其不足，摇瓶效价提高也有限。此外，抗结构类似物菌株筛选、抗性筛选技术也已引起人类的注意［11－13］。本方法结合采用紫外诱变、氯化锂诱变以及抗结构类似物抗性筛选，结合了各种诱变方法的优点，既提高了菌种突变频率，又克服了筛选的盲目性和不定向性，使得筛选出来的突变株摇瓶效价大幅提高。

1 材料和方法

1.1 菌株 龟裂链霉菌TMSⅠ12－66，宁夏泰瑞制药股份有限公司保存。

1.2 主要试剂 氯化锂，天津市凯通试剂有限公司；四环素，湖北巨胜科技有限公司。

1.3 培养基 固体培养基［14］（包括分离培养基和斜面培养基）：玉米淀粉、碳酸钙、硫酸铵、氯化钠、玉米浆。种瓶培养基：玉米淀粉、黄豆饼粉、碳酸钙、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆。发酵培养基：玉米淀粉、黄豆饼粉、碳酸钙、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、玉米浆、淀粉酶、消沫剂。

1.4 方法

1.4.1 单孢子悬浮液的制备 取一支成熟斜面，加入20 mL无菌水，用接种铲轻轻刮下孢子。将孢子液倒入无菌且装有玻璃珠的三角瓶内，震荡、过滤，即得单孢子悬浮液，用无菌水稀释使悬浮液的孢子浓度为107～108个／mL。

1.4.2 紫外诱变 取一定量的孢子悬浮液到培养皿中，放入紫外诱变箱内的磁力搅拌器上，开启紫外灯（30 w），距离30 cm，边照射边搅拌。照射0、30、60、90、120、150和180 s后，稀释，涂布。同时设置未经过诱变的对照组，（37.0±0.5）℃，湿度30%～60%［14］避光培养，培养110～145 h后，记录各组平皿上单菌落形态及数量，并计算致死率。

1.4.3 LiCl助诱变剂 氯化锂是一种化学诱变剂，更是一种助诱变剂，可导致AT－CG碱基发生转换或使碱基缺失，从而导致代谢途径等发生变化，最终产生高产菌株。将未诱变过的菌液涂布于只含有氯化锂的平板上。经培养后，考察不同浓度（2、3、4、5、6 g／L）氯化锂对致死率的影响。

1.4.4 四环素抗性筛选 龟裂链霉素孢子四环素最小抑制浓度（MIC）测定［4］：将制备好的孢子悬液分别涂布于含有不同浓度（3000、3500、4000、4500、5000 mg／L）四环素的培养基平板上，（37.0±0.5）℃，湿度30%～60%条件下培养110～145 h，观察平板上单菌落生长情况。生长菌落但未长出孢子的平板上的四环素浓度即为四环素最小抑制浓度（MIC）。

1.4.5 梯度平板制备 梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入含有一定浓度氯化锂的培养基，立即把培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含最小抑制浓度四环素的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基。

1.4.6 四环素抗性突变株的分离 将紫外线照射过且稀释好的孢子悬液分别涂布于含有氯化锂和最小抑制浓度四环素的氯化锂－四环素梯度平板上，避光（37.0±0.5）℃培养110～145 h。该培养基上生长出来的菌落即为四环素抗性突变株。

1.4.7 抗性菌株斜面的制备 将氯化锂－四环素梯度平板上生长较好、孢子较丰满的单菌落用玻璃棒挑取到加有四环素的斜面培养基上，（37.0±0.5）℃，湿度40%～55%培养70～85 h；（30.0±0.5）℃，25%～65%湿度下培养20～30 h。

1.4.8 抗性突变株摇瓶发酵实验 用接种铲铲取2～3 cm2生长好的孢子斜面接种于种瓶培养基中，装量40 mL／300 mL三角瓶，温度（30.0±0.5）℃，湿度40%～55%，220～230 r／min培养26～28 h。待生长成熟后将2 mL种子液接种到发酵培养基中，发酵瓶装量40 mL／300 mL三角瓶，（30.0±0.5）℃，湿度40%～55%，220～230 r／min培养168～195 h。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变致死率曲线 结果如图1所示。

图1 紫外诱变致死率曲线图

由图1可以看出，随着紫外照射时间的延长，致死率逐渐升高，当诱变时间为90 s左右时，致死率达90%以上。一般认为死亡率较高时诱变效果较好，但也有报道称，较低的致死率有利于正突变菌株的产生。本实验选用致死率为90.3%的90 s作为紫外诱变剂量。

2.2 LiCl实验 不同氯化锂浓度对菌株的致死率见表1，说明单独使用氯化锂对菌株致死率很低，不能达到诱变目的。

表1 LiCl浓度对菌株致死率的影响结果表

2.3 四环素最小抑制浓度 结果见表2。

经试验验证，确定四环素对龟裂链霉菌TMSⅠ12－66菌株的孢子最小抑制浓度为4500 mg／L。

表2 四环素浓度对单菌落的影响结果表

2.4 抗性突变株筛选 制备孢子悬液，将悬液先进行紫外诱变（90 s），再将诱变过的菌悬液稀释至10－4、10－5、10－6浓度，涂布于氯化锂－四环素复合梯度培养基上，避光（36.5±1.0）℃培养5 d。

在梯度平板上共分离得到193株抗性菌株，通过初筛（每组设置3个平行样）获得21株效价高于对照菌株的突变株。再将21株突变菌进行两次复筛（每组设置3个平行样），其结果见表3。

根据三次复筛结果选出效价较高的三株菌TMSⅠ14－114、TMSⅠ14－180、TMSⅠ14－182进行传代稳定性实验。

表3 抗性突变株复筛结果表

2.5 突变株稳定性实验 将复筛结果较理想的3株菌在没有抗性的平板上连续传代，考察其斜面稳定性。传代5次后进行摇瓶发酵验证实验，验证至少3次。稳定性实验结果见图2。

图2 突变株稳定性实验

由图2可知三株突变株中TMSⅠ14－180较稳定。试验结果分析见表4。

表4 稳定性实验结果分析表

由表4可知，变异系数可表示其变异程度的大小，三株菌中TMSⅠ14－114的变异系数为7.87%，TMSⅠ14－180的变异系数为2.11%，TMSⅠ14－182的变异系数为6.12%。由数据可知TMSⅠ14－180的变异系数最小，且从斜面外观来看其菌落形态较规则、孢子也较丰满，故认为该菌株具有较好的遗传稳定性。

3 讨论与小结

3.1 在本次菌种选育过程中，利用紫外＋氯化锂诱变结合抗生素抗性筛选法，克服了筛选的盲目性和不定向性，大大减少了筛选的工作量，提高了菌种选育效率。抗生素的生物合成途径可能会通过分支途径收到严格的反馈抑制，仅能合成一定量的抗生素，因此需要一个遗传上改变调节机制的突变株。筛选结构类似物突变株是使相关酶的调节基因或变构酶的基因发生突变，使结构类似物不能再与阻遏物或变构酶结合，即结构类似物不再抑制突变株的生长或产物的合成，反馈调节被解除，从而大量合成产物［11－12］。四环素为土霉素的结构类似物，利用该方法获得的菌株化学效价提高幅度较大，同时也证明了该选育方法的有效性。

3.2 有大量报道称抗生素抗性基因可能与抗生素结构基因和调控基因存在着一定的联系［15］，抗生素产生菌中的抗性基因与抗生素合成的结构基因紧密连锁，可发生共突变，即抗性突变总是伴随着产量突变［16］，这也从理论上支持了该选育方法的可行性。可用此方法继续对土霉素产生菌进行诱变，期望得到性状更优良的高产菌株。

通过紫外诱变结合抗性筛选并利用梯度平板法处理龟裂链霉菌，从大量单菌落中经过初筛、复筛得到高产土霉素的3株抗性突变株，分别为TMSⅠ14－114、TMSⅠ14－180、TMSⅠ14－182，其化学效价分别为22787、22985和23083 mg／mL，分别比出发菌株提高21.30%、22.36%和22.88%。再通过传代稳定性试验确定了菌株TMSⅠ14－180具有较好的遗传稳定性。

本次设计采用紫外＋氯化锂诱变结合抗底物的结构类似物的筛选法，与其他报道的试验方法相比，既提高了菌种突变频率，又克服了筛选的盲目性和不定向性。另外结合梯度平板法选择抗生素浓度，使实验工作量和实验时间都大大减少，从而提高了菌种选育效率。

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（编辑：侯向辉）

Breeding High－yielding Strains of Oxytetracycline with UV Mutagenesis，Oxytetracycline Resistance Screening and Gradient Plate Method

WANG Xiao－juan，ZHANG Ping，PANG Chun－mei，SHI Yan－peng∗
（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co Ltd，Yinchuan 750101，China）

UV mutagenesis，antibiotics resistance screening and gradient plate method were used to screen highyielding strains of oxytetracycline directionly by using Streptomyces rimosus TMSⅠ12－66 as the original strain.The results showed that the dose of UV irradiation was determined 90 s in term of death rate.Using isolation medium with lithium chloride on the upper layer and tetracycline on the bottom layer，a high－yield oxytetracycline－producing strain named TMSⅠ12－66 was obtained，whose shaking production reached 22985 mg／mL，increased by 22.36%than the original strain，its character was stable after five generations.

Streptomyces rimosus；UV mutagenesis；resistance screening

2014－09－15

A

1002－1280（2014）11－0024－05

S852.61

王小娟，硕士，从事抗生素发酵育种研究。

石彦鹏。E－mail：shiyanpeng＠tairuiworld.com