长春地区猪源大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析

王基伟，孙洋，纪雪，刘军，祝令伟，周伟，佟盼盼，郭学军，李晓慧，冯书章∗

长春地区猪源大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析

王基伟1，2，孙洋2，3，纪雪2，3，刘军2，3，祝令伟2，3，周伟2，3，佟盼盼2，3，郭学军2，3，李晓慧3，4，冯书章2，3∗

（1.吉林农业大学动物科技学院，长春130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春130122；3.吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130062；4.吉林省畜牧兽医科学研究院，长春130062）

为了解吉林省长春地区猪源大肠杆菌的耐药情况，于2013年采集318份猪源样品，分离鉴定大肠杆菌275株。以氨苄西林、头孢噻肟等15种药物进行了药物敏感性实验，多重PCR方法进行系统进化分群。结果表明，大肠杆菌分离株对四环素、氨苄西林和磺胺甲基异恶唑耐药最严重（83.63%、52.72%、51.27%），全部菌株对美洛培南、多粘菌素敏感，其中176株菌表现为对3类以上抗生素的多重耐药（64.00%）。从仔猪腹泻样品分离大肠杆菌对β－内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素、氯霉素及磺胺甲基异恶唑的耐药率显著高于健康猪和猪肉样品分离株的耐药率。大肠杆菌分离株主要为A群和B1群。研究获得了吉林长春地区猪源大肠杆菌耐药性的基本流行病学数据，为指导养殖业的临床用药及耐药性监测提供了依据。

猪；大肠杆菌；耐药性

大肠杆菌是人和动物肠道共生菌群的组成部分，部分致病性大肠杆菌能引起尿道感染等多种传染病［1］。大肠杆菌可能作为耐药基因的储存库，将耐药性基因传播至其他肠杆菌科细菌或其他烈性病原菌。我国一些猪场为了预防疾病发生盲目用药、过量用药，滥用抗生素的现象屡见不鲜［2］，细菌耐药性呈现耐药率不断上升，耐药谱广，多重耐药，耐药传播加速等趋势。从生猪饲养、屠宰到猪肉的消费，耐药菌可能通过这一链条传播给人类，产生严重的公共卫生问题。本研究对吉林省长春地区猪源样品进行了大肠杆菌的分离鉴定及耐药谱分析，以期为合理使用抗生素和耐药性监测提供依据，并为进一步研究耐药性的传播机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品来源 2013年从长春地区采集生猪肛门拭子样品191份、猪肉样品96份（屠宰场及农贸市场）和仔猪腹泻样品31份。

1.2 试剂及培养基 麦康凯琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌显色培养基购自法国科玛嘉公司；MH琼脂购自法国梅里埃公司；氯霉素、四环素、氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、美洛培南、庆大霉素、磺胺甲基异恶唑、阿米卡星、多黏菌素B、环丙沙星和左氧氟沙星药敏片，购自Oxoid公司；PCR试剂、DNA Marker DL2000，购自日本TaKaRa公司；大肠杆菌质控菌株ATCC25922由本实验室保存。引物由invitrogen公司合成（表1）。

1.3 猪源大肠杆菌分离鉴定

1.3.1 大肠杆菌分离培养 将猪肛拭子样品及仔猪腹泻粪便拭子样品加入2 mL 0.85%生理盐水，室温振荡混匀10 min，静置3 min；猪肉样品以无菌棉签擦拭猪肉表面，样品于无菌生理盐水振荡悬浮；每样品分别吸取10 μL上清于科玛嘉培养基平板划线，37℃培养16 h，挑取紫红色典型菌落在麦康凯培养基二次划线纯化。

1.3.2 大肠杆菌PCR鉴定 于麦康凯培养基挑取符合大肠杆菌形态特定的单菌落，接种LB肉汤培养基，37℃培养16 h，制备PCR模板，以大肠杆菌16S rDNA特异性引物做PCR鉴定［3］。

1.4 药敏实验 实验选取15种具有代表性的抗菌药物，包括β－内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等7大类。依据CLSI推荐方法［4］，采用Kirby－Bauer纸片扩散法，根据抑菌圈大小判断耐药（R）、中介（I）和敏感（S），大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，多粘菌素的耐药判断按照丹麦细菌耐药监测系统（DAN－MAP）所使用的标准［5］。

1.5 细菌的进化分群 采用多重PCR方法对大肠杆菌进行分群，将大肠杆菌分成A、B1、B2、D共四个群，实验方法参照文献［6］。

表1 试验所用PCR引物

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定 从318份样品中分离275株非克隆株大肠杆菌，经大肠杆菌16S rDNA特异性引物PCR鉴定，均为大肠杆菌。

2.2 大肠杆菌系统进化分群 275株猪大肠杆菌系统进化分群多重PCR结果统计A群：201株；B1群：33株；B2群：13株；D群：28株。结果显示属A群的分离株较多，B1、D、B2群数量依次降低，一般认为B2和D群多属致病性的大肠杆菌，这两群大肠杆菌占总分离数的14.90%。从表2可以看出，腹泻仔猪大肠杆菌分离株B2和D群的比例高于健康猪大肠杆菌。

表2 猪源大肠杆菌分离株分群结果表

2.3 药敏实验结果 大肠杆菌分离株对临床治疗和预防常用药物如四环素、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、氯霉素和阿米卡星，耐药率分别为83.63%，51.27%，52.72%，39.27%，28.00%。对第三代头孢菌素耐药率较低，头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟耐药率分别为3.27%，4.36%，5.45%。对亚胺培南，阿莫西林／克拉维酸和第三代头孢菌素耐药率最低。对美洛培南和多粘菌素均敏感。统计结果表明，从仔猪腹泻样品分离大肠杆菌对氨苄西林（90.32%）、庆大霉素（48.38%）、左氧氟沙星（58.06%）、环丙沙星（67.74%）、磺胺甲基异恶唑（70.96%）、氯霉素（54.83%）的耐药率显著高于健康猪肛试子和猪肉样品分离株的耐药率（表3、表4）。

表3 猪源大肠杆菌对抗菌药物的敏感性结果

表4 猪源大肠杆菌药物敏感性与分群的相关性

2.4 耐药谱分析 结果如表5所示，仅有11株分离株对15种药物全部敏感（4.00%），有61株菌只对一种抗生素耐药，其余203株大肠杆菌表现为对2种以上抗菌药物耐药。1～3种抗生素耐药菌株有134株（48.72%）；4～6种抗生素耐药菌株有92株（33.45%）；7～9种抗生素耐药菌株有33株（12.00%）；10～12种抗生素耐药菌株有5株（1.81%）。

表5 275株猪大肠杆菌的耐药模式

实验的15种抗生素可归为四环素类、氨基糖苷类、β－内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类和多肽类抗菌药物。多重耐药表型一般定义为同时对≥3类抗生素耐药，统计结果表明（图1），多重耐药菌数达176株（64.00%），多耐药菌株耐6类抗生素的比例最大，占25.66%，所耐抗生素的种类是β－内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、氯霉素类和磺胺类药物。

3 讨论与小结

本研究对长春地区猪源大肠杆菌耐药情况进行初步调查，实验选取具有代表性15种抗菌药物进行药物敏感试验。在选择的15种抗菌药物中，四环素对大部分大肠杆菌分离株已基本失去作用（83.63%），这由于四环素类抗生素价格低廉，抗菌谱广，养殖户长期大量使用这些药物进行预防和治疗，造成了对此类药物的广泛耐药，与药敏检测结果相符。但对头孢他啶，头孢噻肟，头孢曲松，亚胺培南，美洛培南，多粘菌素均较敏感。调查发现，这几种药物成本较高，养殖户很少使用。与国内不同地区猪源大肠杆菌耐药性研究结果比较，发现长春地区猪源大肠杆菌耐药率较其他地区普遍偏低，2010年河南地区规模化猪场病料样品分离大肠杆菌对四环素，庆大霉素，环丙沙星，氯霉素的耐药率分别为94.80%，63.80%，72.40%，63.80%［7］。本实验从腹泻样品分离大肠杆菌对四环素，庆大霉素，环丙沙星，氯霉素的耐药率分别为87.09%，48.38%，67.74%，54.83%。2009年广东屠猪肉样品分离大肠杆菌对四环素，庆大霉素，氨苄西林，氯霉素的耐药率分别为88.39%，33.93%，77.68%，67.85%。本实验从猪肉样品分离大肠杆菌对四环素，庆大霉素，氨苄西林，氯霉素的耐药率分别为69.09%，20.00%，45.45%，30.90%［8］。产生此种现象原因可能是不同地区养殖模式和预防观念的不同，南方多大规模养殖，预防为先，治疗为辅。北方散养户居多，治疗为先，预防为辅。为了提高饲料转化率，促进畜禽生长，规模化养殖在饲料中添加大量抗生素，对耐药性菌株进行人工选择。所以大规模养殖地区猪源大肠杆菌耐药率更高，长春地区猪源大肠杆菌耐药率相对较低，但耐药情况仍很严重，不容忽视。

研究结果表明，猪源大肠杆菌B2和D群分离株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、四环素的耐药率分别为60.00%，10.00%，10.00%，10.00%，45.00%，92.50%。猪源大肠杆菌肠道B1和A群分离株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、四环素的耐药率分别为51.48%，3.40%，3.82%，1.27%，35.31%，82.12%。统计数据表明，猪源大肠杆菌B2和D群分离株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、四环素的耐药率均高于猪源大肠杆菌肠道B1和A群分离株的耐药率（表4）。本实验仔猪腹泻样品分离株耐药情况较其他样品分离株严重，经过调查发现，养殖户对于腹泻仔猪的治疗，几乎不进行任何药敏试验，盲目用药和过量用药情况十分严重，可能引起了仔猪腹泻样品分离株耐药情况更严重。

伴随着养猪业蓬勃发展，抗生素的使用量也空前增长，据统计我国每年抗生素原料生产量约为21万吨，其中有46.10%用于畜牧养殖业［9］。根据美国疾病预防控制中心的资料，美国使用的抗生素促生长剂包括17大类，几乎包括了治疗人类感染的全部抗生素种类［10］。我国是养猪大国，猪肉是人们日常消费食品，猪肉食品安全问题越来越受到人们的关注。因养猪业中大量使用抗生素，使得在养殖环境中，形成细菌耐药基因贮存库，耐药性细菌可通过生猪—猪肉—人的链条传播给人类。这些细菌能以人类和动物相重叠的共生菌为载体，转移抗生素耐药性基因［11］，对人类健康造成巨大威胁。我国吉林长春地区猪源大肠杆菌呈现耐药谱广、耐药率高、多重耐药情况严重的特点，相关部门应高度重视，制定相应的监测机制和养殖业抗生素的使用规范。

［1］ Guo－Bao Tian，Hong－Ning Wang，An－Yun Zhang，et al.Detection of clinically important b－lactamases incommensal Escherichia coli of human and swine origin in western China［J］.Medical Microbiology，2012，61：233－238.

［2］ 顾玉芳，罗一龙.猪场抗生素使用情况及市售猪肉抗生素残留调查［J］.长江大学学报，2012，9（1）：203－205.

［3］ Shailesh K Shahi，Vinay K Singh，Ashok Kumar.Detection of Escherichia coli and associated β－Lactamases genes from diabetic foot ulcers by multiplex PCR and molecular modeling and docking of SHV－1，TEM－1，and OXA－1 β－Lactamases with clindamycin and piperacillin－tazobactam［J］.PloS one，2013，8（7）：1－13.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Twenty－Second Informa⁃tional Supplement.January 2012.

［5］ DANMRP.DANMAP 2006－consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals，food and humans in Denmark［EB／OL］.

［6］ Clermont O，Bonacorsi S，Bingen E.Rapid and simple determi⁃nation of the Escherichia coli phylogenetic group［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（10）：4555－4558.

［7］ 孙迎，廖晓萍，王秀梅，等.广东屠猪肉样品中大肠杆菌耐药性与毒力特征的分析［J］.中国预防兽医学报，2011，（33）：33－36.

［8］ 于佳阳.湖南省规模化猪场猪源大肠杆菌耐药性调查［J］.中国猪业，2010，（11）：23－25.

［9］ 王云鹏，马越.养殖业抗生素的使用及其潜在危害［J］.中国抗生素杂志，2008，33（9）：519－522.

［10］nderson A D，McClellan J，Rossiter S，et al.Appendix a public health consequences of use of antimicrobial agents in agriculture［M］／／Knobler S L，Lemo n S M，Najaf C M，et al.The resistance phenomenon in microbes and infectious disease vectors：Implications for human health and strategies for containment：Workshop Summary.ashington：Nat ional Aca demies Press，2003，231－243.

［11］崔泽林，郭晓奎.食物链中抗生素耐药性基因的转移［J］.中国微生态学杂志，2011，23（1）：89－92.

（编辑：侯向辉）

Antimicrobial Resistance of Escherichia coli Isolated from Swine in Changchun

WANG Ji－wei1，2，SUN Yang2，3，JI Xue2，3，LIU Jun2，3，ZHU Ling－wei2，3，ZHOU Wei2，3，TONG Pan－pan2，3，GUO Xue－jun2，3，LI Xiao－hui3，4，FENG Shu－zhang2，3∗
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Institute of Veterinary Science，The Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122，China；3.Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prerention and Contral，Changchun 130062，China；4.Veterinary Institute in Jilin Province，Changchun 130062，China）

In order to investigate the antimicrobial resistant of Escherichia coli from swine，a total of 275 Escherichia coli were recovered from 318 swine origin samples in Chuangchun in Jilin province，The phylogenetic background determinated by multiplex PCR.Susceptibility of 275 isolates to fifteen antimicrobial agents were tested.Among swine E.coli isolates，83.63%were resistant to tetracycline，52.72%to ampicillin and 51.27%to sulfamethoxazole.Most of the isolates（176）were multiple resistant bacteria strains；it meant that 64%of the E.coli strains were resistant to more than 3 kinds of antimicrobial agents.All of the isolates were sensitive to meropenem and polymyxin B.In addition，the drug－resistant rates to quinolones，tetracycline，chloramphenicol，sulfanilamide，and β－lactam antibiotics of the E.coli isolates from diarrhea piglets are remarkbly higher thanthose isolates from healthy swine and pork.The majority of isolates belonged to phylogenetic group A and B1.In this study，epidemiological background and basic data of drug resistance of E.coli from swine in Chuangchun in Jilin province.It could give some directions to clinical medication and drug resistance surveillance.

swine；Escherichia coli；drug resistance

2014－08－12

A

1002－1280（2014）11－0014－05

S852.61

国家科技重大专项（No.2013ZX10004－217－002）；863项目（2012AA022006）；广州市科技计划项目（No.201300000036）

王基伟，硕士研究生，从事预防兽医学研究。

冯书章。E－mail：fengsz＠hotmail.com