猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析

郎洪武，刘丹，陈晓春，方超，高金源，吴华伟，邓永，陈建

（中国兽医药品监察所，北京100081）

［收稿日期］2014－07－31 ［文献标识码］A ［文章编号］1002－1280（2014）11－0001－04 ［中图分类号］S852.65＋9.2

猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析

郎洪武，刘丹，陈晓春，方超，高金源，吴华伟，邓永，陈建

（中国兽医药品监察所，北京100081）

［收稿日期］2014－07－31 ［文献标识码］A ［文章编号］1002－1280（2014）11－0001－04 ［中图分类号］S852.65＋9.2

为了解我国猪圆环病毒2型（PCV2）的流行态势和毒株的基因变异情况，从北京、江苏、湖北等地疑似断奶仔猪多系统综合征（PMWS）患病死亡猪中采集肺脏、脾脏和淋巴结等组织，将PCR鉴定为阳性的病料在PK－15细胞上进行增殖培养，成功分离到6株猪圆环病毒2型毒株，分别命名为B07、B12、HB、LHW、LPC和NJ。对其全基因组进行克隆和序列分析的结果显示，LPC基因组全长为1766 bp，其余均为1767 bp；6个毒株序列之间同源性高达96.0%～99.9%，6个毒株与参考毒株序列的同源性为94.4%～99.8%。PCV2全基因组的进化分析结果表明，B12、HB、LHW、LPC和NJ为PCV2b亚型，B07为PCV2d亚型，从而证实PCV2b亚型毒株成为我国猪群中分离率较高的流行毒株，并且我国猪群存在PCV2d亚型毒株。

猪圆环病毒2型；全基因组；序列分析

猪圆环病毒（PCV）分为2种基因型，即PCV1型基因组和PCV2型基因组。其中PCV1不引起临床症状，广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞，PCV2对各种年龄的家猪和野猪均有致病性［1］。PCV2基因组全长为1766 bp、1767 bp或1768 bp，通常含有11个ORF，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10在病毒链上，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11在互补链上，这些基因表现为重叠基因，从而充分利用了病毒有限的遗传物质［2］。ORF1和ORF2是两个主要的开放阅读框，分别编码与病毒复制有关的Rep′蛋白和病毒的衣壳蛋白（Cap）。

对于PCV2基因分型，很多学者都提出了各自不同的原则和方法。欧盟猪圆环病毒病委员会提出的将PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c三种基因亚型的分类方法被广泛接受，其分型的基本原则是全基因遗传距离大于0.02和ORF2基因遗传距离大于0.035，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型［3］。

但国内也有学者认为我国存在PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2e 4个基因型，各基因型间遗传距离介于0.036～0.064［4］，并且PCV2b已成为近年来国内流行毒株的优势基因型。本研究对北京、江苏、湖北等地猪场进行了PCV2分离，并对分离到的PCV2毒株进行了全基因组序列分析，这对了解我国PCV2流行毒株的遗传进化和致病性具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 病料和细胞 从北京、江苏、湖北等地疑似发生断奶仔猪多系统衰竭综合征猪场，无菌采集发病猪肺脏、脾脏和淋巴结等组织，置－70℃保存备用。PK－15细胞由本实验室保存；E.coli DH5α感受态细胞，购于天根生化科技有限公司。

1.2 基因克隆相关试剂 基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、Marker V，均购自北京天根公司；Ex Taq DNA聚合酶和pMD18－T载体购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计参照中国人民共和国国家标准中猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法［5］，合成3条引物，用于病料中猪圆环病毒2型的鉴定，扩增片段大小为1154 bp。引物序列为：

P1：CCGCGGGCTGGCTGAACTT； P2：CTCGGCTAGCGCTCCAAAATG；

P3：ACCCCCGCCACCGCTACC；

根据GenBank上公布的PCV2全基因组序列，设计合成一对引物用于扩增PCV2全基因组，目的片段大小为1767 bp。上游引物为PCV2－P1：GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT；下游引物为PCV2－P2：GCACCGCGGAAATTTCTGA⁃CAAACGTTACA。

1.4 病料的PCR扩增 将采集的病料剪成小块，加入PBS后将病料匀浆制成悬液，按照DNA提取试剂盒操作说明，提取组织DNA，以提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5mmol／L each）4 μL，P1、P2和P3引物各1 μL，模板5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，补加ddH2O至50 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；94℃30 s，62℃45 s，72℃45 s，共35个循环；72℃10 min。反应结束后取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。

1.5 病毒的分离和培养 将1.4检测PCV2为阳性的病料匀浆制成悬液，反复冻融3次，5000 r／min离心20 min，取上清经0.22 μm滤膜过滤，分别按1∶10同步接种PK－15细胞，24 h后用300 mmol／L的D－氨基葡萄糖处理30 min后弃之，用PBS轻轻洗涤细胞3次，再加入适量维持液，置37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养48 h，盲传5代后收获细胞培养物。

1.6 PCV2全基因组的克隆和测序 将盲传5代后收获的细胞培养物，按照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取病毒DNA。以提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系同1.4。反应条件为：95℃预变性5 min；94℃30 s，57℃40 s，72℃1 min 30 s，共30个循环；72℃10 min。反应结束后取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。对与预期片段大小相符的PCR扩增产物用胶回收试剂盒进行切胶回收，连接到pMD18－T Simple载体，转化到DH5α感受态细胞，经涂板和摇菌后将PCR鉴定为阳性的菌液送北京华大科技公司测序。

1.7 测序结果分析 用DNAStar 7.1生物软件对分离到的PCV2野毒全基因组测序结果进行序列比对和同源性分析，用Mega 6.06软件绘制进化树进行系统进化分析。

2 结果

2.1 病料的PCR扩增 将疑似PCV2的病料分别匀浆制成悬液，提取组织DNA，参照中国人民共和国国家标准中猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法进行PCR扩增。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有6份病料扩增出1154 bp的特异条带（图1）。

2.2 PCV2全基因组扩增 收获第5代细胞培养物，按照基因组DNA提取试剂盒操作说明提取病毒DNA，进行PCV2全基因组序列扩增，结果显示6个毒株均可以扩增到1767 bp大小的核酸条带（图2）。

图2 PCV2分离毒株全基因PCR扩增结果

2.3 核苷酸序列的同源性比较和系统进化分析根据测序结果对PCV2全基因组进行序列拼接，其中PCV2 B07、B12、HB、LHW、和NJ全长均为1767 bp，LPC全长为1766 bp。从GenBank收录的毒株序列中选取PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d和PCV2e 5种亚型的参考毒株序列共10株，用DNAStar 7.1软件中的MegAlign方法与获得的6株PCV2野毒序列进行比较，发现分离的6个毒株序列之间同源性较高，高达96.0%～99.9%；分离的6个毒株与参考毒株序列的同源性也较高，达到94.4%～99.8%（图3）。

图3 PCV2分离株全基因序列比较

通过Mega6.06的Neighbor－Joining方法进行系统进化分析，所测得的6个毒株有5个（B12、HB、LHW、LPC和NJ）属于PCV2b亚型，1个毒株（B07）为PCV2d亚型（图4），说明PCV2b亚型是优势流行毒株。

2.4 PCV2分离毒株的ORF2基因变异分析 本研究得到5株PCV2b和1株PCV2d亚型毒株，通过DNAStar软件发现，B12、HB、LHW和NJ毒株其ORF2均在1033～1734位，编码的Cap蛋白为233个氨基酸，LPC的ORF2在1026～1733位，编码的Cap蛋白为235个氨基酸；PCV2d毒株B07的ORF2在1030～1734位，编码的Cap蛋白为234个氨基酸（图5）。

图4 PCV2分离株全基因序列系统进化树

图5 PCV2分离毒株和参考毒株ORF2编码的Cap蛋白氨基酸比对结果

3 讨论

对PCV2的基因组分析发现，所有PCV2分离株的基因组同源性都在90%以上，但与PCV1的核苷酸同源性却只有68%～79%。本研究通过对北京、江苏、湖北等地分离到的PCV2基因组分析发现，分离到的6个PCV2毒株序列之间同源性高达96.0%～99.9%，6个毒株与参考毒株序列的同源性为94.4%～99.8%。由于分离到的毒株与国内外已报道的毒株序列不完全相同，因此分离到的毒株具有地方代表性。最新的研究把我国PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2e 4个基因型，其中PCV2b是近年来我国的优势流行毒株。本研究分离到的6个毒株，其中的5个为PCV2b亚型，一个为PCV2d亚型，再一次证实了PCV2b是我国的优势流行毒株。

由于ORF2变异性较大，并且Cap蛋白与PCV2致病性有密切关系，本研究将分离毒株的ORF2基因序列与不同亚型PCV2代表毒株的氨基酸进行比较，发现突变集中在170～230位氨基酸处，并且不同亚型ORF2的氨基酸同源性较高，变异较小。

本研究通过对北京、江苏、湖北等地PCV2分离毒株序列的分析及同源性研究，明确了这些地区PCV2流行毒株的基因组特征，支持了我国PCV2分型的依据，为PCV2的防控和疫苗研究筛选基因优势型毒株提供了理论依据。

［1］ Allan G，Krakowka S，Ellis J，et al.PCV2：ticking time bomb［J］.Pig Progress，2002，18：14－15.

［2］ 琚春梅.猪圆环病毒复制与转录模式研究进展［J］.动物医学进展，2007，4：35－36.

［3］ Segales J，Olvera A，Grau－roma L，et al.PCV－2 genotype definition and nomenclature［J］.The Veterinary Record，2008，162：867－868.

［4］ XINNA GE A，FANG WANG B，XIN GUO A，et al.Porcine circovirus type 2 and its associated diseases in China［J］.Virus Research，2012，164：100－106.

［5］ GB／T 21674－2008猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法［S］.

（编辑：李文平）

Cloning and Sequence Analysis of the Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 Isolate

LANG Hong－wu，LIU Dan，CHEN Xiao－chun，FANG Chao，GAO Jin－yuan，WU Hua－wei，DENG Yong，CHEN Jian
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China）

To understand the prevalent trend and genetic variations of procine circovirus type 2（PCV2）in our country，lungs，spleens and lymphonodi associated with postweaning multisystemic wasting syndrome（PMWS）were collected from Beijing，Jiangsu and Hubei province，and the disease materials that proved to be positive by polymerase chain reaction（PCR）were cultured in PK－15 cells.Six PCV2 strains were successfully isolated and marked as B07，B12，HB，LHW，LPC and NJ，respectively.The complete genome of 6 isolated strains was cloned，sequenced and analyzed.Results showed that the full length of genomic sequence of LPC was 1766 bp，while the others were 1767 bp.The 6 isolated strains showed high identity with each other（96%～99.9%）and the identity between 6 isolated strains and the reference viruses was 94.4%～99.8%.Phylogenetic analysis demonstrated the isolated strains B12，HB，LHW，LPC and NJ were classified into PCV2b genotype，B07 was classified into PCV2d genotype.In conclusion，PCV2b group strain was predominant prevailing strain and the pig farms had PCV2d group strain infection.

porcine circovirus type 2；complete genome；sequence analysis

郎洪武，博士，副研究员，从事猪病毒类兽用生物制品检验及相关的科研工作。E－mail：zhjshcvlhw＠126.com