UPLC－MS／MS测定4种兽药制剂中非法添加阿托品的方法研究

胡兴娟，吴宁鹏，董瑞静，董晓盈，李慧素，班付国

（1.河南省兽药饲料监察所，郑州450008；2.郑州中道生物技术有限公司，郑州450000；3.郑州后羿制药有限公司，郑州450000）

UPLC－MS／MS测定4种兽药制剂中非法添加阿托品的方法研究

胡兴娟1∗，吴宁鹏1，董瑞静2，董晓盈3，李慧素1，班付国1

（1.河南省兽药饲料监察所，郑州450008；2.郑州中道生物技术有限公司，郑州450000；3.郑州后羿制药有限公司，郑州450000）

建立了兽药中非法添加药物阿托品的超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS／MS）的检测方法。样品经提取稀释，采用BEH C18柱为分离柱，外标法定量。结果表明，阿托品在0.5～10 ng／mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.99。在4～6 mg／g（或mg／mL）添加浓度范围内阿托品的平均回收率97.4%～110.9%，批内变异系数均小于10%，检测限为0.2 mg／g（或mg／mL），定量限为0.5 mg／g（或mg／mL）。该方法简便、灵敏度高、重现性好，适用于兽药中非法添加阿托品的含量测定。

阿托品；兽药；超高效液相色谱－串联质谱

阿托品（atropine）是从茄科植物颠茄、曼陀罗及莨菪中分离提取的一种M胆碱受体阻断药，具有解除平滑肌的痉挛、抑制腺体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制、兴奋呼吸中枢等药理活性，在兽医临床上主要用来作为解毒药、缓解有机磷中毒的症状、抑制肠炎。根据其药理特点，一些兽药企业在兽药生产过程中非法添加非处方药阿托品，以增强药效，从而获得非法利润。因此，为打击兽药中非法添加阿托品，保障养殖业用药安全，建立兽药中非法添加阿托品的测定方法是非常必要的。

国内外阿托品含量的测定通常采用比色法［1－2］、高效液相色谱（HPLC）［3－4］和液相色谱串联质谱法（LC－MS／MS）［5－7］，兽药中非法添加阿托品的检测方法尚未见报道。阿托品属于紫外末端吸收，HPLC检测时易有杂质峰干扰，本研究选择了灵敏度更高的质谱为检测器。因此，本研究以超高效液相色谱串联质谱法（UPLC－MS／MS）为检测手段，首次建立了硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸黏菌素预混剂、氧氟沙星注射液及烟酸诺氟沙星注射液等4种兽药制剂中阿托品的检测方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超高效液相色谱－串联质谱仪（美国Waters公司）；XP205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS3 basic涡旋混合器（IKA）。

1.2 试药 阿托品标准品含量为96.5%，购于中国药品生物制品检定所；阿托品原料药由河南省某制药公司提供；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；硫酸黏菌素可溶性粉（10%）、硫酸黏菌素预混剂（20%）、氧氟沙星注射液（2%）及烟酸诺氟沙星注射液（2%）均为市售样品，经检测不含阿托品；实验用水为经Milli－Q净化系统制备的去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；流速：0.3 mL／min；柱温：40℃；进样量：2 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；电离电压：2.5 kV；源温：150℃；脱溶剂温度：500℃；锥孔气流速为150 L／h，脱溶剂气流速为1000 L／h；定性离子对、定量离子对及对应的碰撞能量参考值见表2。

表2 阿托品保留时间及定性、定量离子对

2.3 溶液的制备方法

2.3.1 标准溶液的配制 准确称取标准品约10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中；配制成1 mg／mL的标准储备液。－20℃下保存，有效期为三个月。准确移取标准储备液适量，用水稀释成一定浓度的标准工作液。

2.3.2 阴性空白溶液 取无非法添加的各制剂1.0 g或1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀（硫酸黏菌素预混剂加100 mL水后，水浴超声10 min，过滤，取续滤液。）精密量取1.0 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按上述步骤再稀释100倍，作为阴性空白溶液。

2.3.3 空白添加溶液 取无非法添加的各制剂，分别按0.4%、0.5%、0.6%的浓度添加阿托品，按2.3.2阴性空白溶液操作制备成各制剂的空白添加溶液。

2.3.4 样品溶液 按2.3.2制备。2.4 测定方法 准确量取2.3.1－2.3.4制备的溶液各1 mL，过0.22 μm滤膜，进液相色谱－串联质谱仪测定。

2.5 结果

2.5.1 线性关系 取2.3.1标准工作液适量，用水稀释制得0.5、1、2、5、10 ng／mL浓度的溶液，从低浓度到高浓度依次进样分析，以标准溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图1）；求得线性回归方程：A＝39176.7C＋21669.1，R＝0.9994。

图1 阿托品标准曲线图

2.5.2 检测限和定量限 空白试样按相同的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试料对所测药物无干扰。检测限：取适量阿托品标准溶液，进行梯度稀释后添加到阴性对照制剂中，按方法进行检测，依据信噪比S／N＞3（按PtP算），确定阿托品的检测限为0.2 mg／g（或mg／mL）。

定量限：取适量阿托品标准溶液，进行梯度稀释后添加到阴性对照制剂中，按方法进行检测，依据信噪比S／N＞10（按PtP算），确定阿托品的定量限为0.5 mg／g（或mg／mL）。

2.5.3 方法精密度与准确度 取1.4.3阳性添加样品每个浓度做3个平行，其平均回收率、变异系数如表3所示。可以看出阿托品批内平均回收率为97.4%～110.9%，批内变异系数小于10%。阿托品标准溶液、阴性氧氟沙星注射液对照品和阴性氧氟沙星注射液对照品添加色谱图（图2－图4）。

表3 兽药中添加阿托品回收率试验结果

图2 阿托品标准溶液色谱图（5 ng／mL）

图3 氧氟沙星注射液空白色谱图

图4 氧氟沙星注射液空白添加色谱图（5 ng／mL）

3 讨论与小结

3.1 质谱条件优化 将200 ng／mL的标准溶液流动注射进样，在m／z 50～1000扫描范围内以正离子模式进行一级质谱图扫描，发现阿托品的［M＋H］＋峰均比较强，故选择［M＋H］＋作为母离子。根据欧盟2002／657／EC要求，要确证该类物质至少需要4个识别点（IP）［8］，因此，分别选择了母离子以及对应的两个响应较强的子离子作为定性定量依据。

3.2 流动相的选择 本研究比较了多种流动相体系，包括水－乙腈、0.1%甲酸－乙腈［9］、水－甲醇、0.1%甲酸－甲醇四种体系作为流动相对色谱分析的影响。实验表明，流动相中加入0.1%甲酸离子化效果好，灵敏度高，最后确定0.1%甲酸－乙腈为流动相。采用梯度可以使杂质峰和阿托品有效分离。

3.3 基质效应 阿托品阳性添加供试样品稀释106倍后上机测定，与相同浓度的阿托品标准溶液色谱峰比较，结果表明，两者响应值相差无几，样品基质对阿托品的离子化不存在基质效应，故本方法以标准曲线对样品进行定量分析。

本研究首次建立了以超高效液相色谱串联质谱（UPLC－MS／MS）为检测手段，测定兽药中非法添加药物阿托品的的分析方法，该方法具有灵敏、快速、准确等特点，适用于硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸黏菌素预混剂、氧氟沙星注射液及烟酸诺氟沙星注射液中阿托品的非法添加测定，为兽药监管提供技术支撑。

［1］ 王慧.比色法测定硫酸阿托品滴眼液中硫酸阿托品的含量［J］.北方药学，2014，11（3）：9.

［2］ 陈海燕，韦素华.酸性染料比色法和高效液相色谱法测定硫酸阿托品片含量的比较［J］.轻工科技，2014，1：111.

［3］ 金鸣，张福荣，蔡向阳等.高效液相色谱法快速测定人血、尿中的阿托品［J］.中国医院药学杂志，2005，25（5）：426－428.

［4］ 杨强，金晓峰.高效液相色谱法测定硫酸阿托品注射液的含量［J］.中国畜牧兽医，2010，37（2）：221－222.

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［6］ Silvia Jakabová，Lajos Vincze，Ágnes Farkas，et al.Determination of tropane alkaloids atropine and scopolamine by liquid chromatographymass spectrometry in plant organs of Datura species［J］.Journal of Chromatography A，2012，1232：295－301.

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［8］ Commission of the European Communities.2002／657／EC［S］.2002.

［9］ 胡兴娟，吴宁鹏，孟蕾等.超高效液相色谱－串联质谱法测定猪肉、猪肝及猪尿中的阿托品残留［J］.中国兽药杂志，2014，48（7）：46－49.

（编辑：曹佳）

Determination of Atropine Illegally Added in Veterinary Drugs by UPLC－MS／MS

HU Xing－juan1∗，WU Ning－peng1，DONG Rui－jing2，DONG Xiao－ying3，LI Hui－su1，BAN Fu－guo1
（1.Henan Institute of Veterinary Drug＆Feed Control，Zhengzhou 450008，China；2.Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co.，Ltd，Zhengzhou 450008，China；3.Zhengzhou Houyi Pharmaceutical Co.，Ltd，Zhengzhou 450000，China）

A method based on ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）was developed for determination of atropine in veterinary drugs.The analyte was extracted and diluted with water，with BEH C18 as the analytical column.Quantification of the analyte was using external standard method.The results indicated that the correlations of atropine were greater than 0.99 in the range of 0.5～10 ng／mL.The average recoveries of the drug ranged from 97.4%～110.9%at spiked levels of 4～6 mg／g（mg／mL）with RSD less than 10%.The detection limit and quantification limit of the method were 0.2 mg／g（mg／mL）and 0.5 mg／g（mg／mL）.The method was convenient，rapid，sensitive and reproducible for monitoring atropine illegally added in veterinary drugs.

atropine；veterinary drugs；UPLC－MS／MS

2014－07－27

A

1002－1280（2014）11－0049－04

S859.79

2014年国家畜禽产品质量安全风险评估项目（编号：GJFP2014007）

胡兴娟，硕士研究生，从事药物分析与分离研究。E－mail：xingjuanhu＠sina.cn