Ang-1和Tie2在高血压患者内皮祖细胞中表达水平及临床意义研究

冯 晓 潘 峰 张腊红 楼洪萍 张邢炜 陈兆军

杭州师范大学附属医院，浙江杭州 310015

高血压的严重程度与血管内皮细胞的损害程度呈正相关，作为前体细胞，内皮祖细胞具有较强的增殖、分化潜能，参与损伤内皮细胞的修复、维持血管稳定，因此对于防止动脉粥样硬化及再狭窄具有重要意义[1-2]。血管生成素-1（Ang-1）及其酪氨酸激酶受体Tie2是血管生成的重要调节因子，广泛表达于内皮祖细胞上，对于调控内皮祖细胞的功能具有重要意义[3-4]。本研究通过不同分级的原发性高血压患者内皮祖细胞Ang-1/Tie2的表达变化，探讨Ang-1/Tie2信号通路在修复与逆转疾病发展中的重要价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择杭州师范大学附属医院2012年1月～2013年6月住院的原发性高血压患者45例为观察组，其中男 23例，女 22例；年龄 38～71岁，平均（54.35±6.58）岁；依据WHO/ISH对高血压的诊断和分级标准，分为Ⅰ级[血压（145～159）/（90～99）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）]、Ⅱ级[血压（160～179）/（100～109）mm Hg]和Ⅲ级[血压≥180/110 mm Hg]高血压患者，各15例。选择同时期正常体检人群30名为对照组，男女各15名；年龄 39～70 岁，平均（53.64±6.17）岁。 各组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。剔除糖尿病、溃疡、外伤、近期外科手术、肿瘤、炎症等影响内皮祖细胞疾病的患者以及近3个月无急性心肌梗死、心绞痛发生患者。

1.2 方法和试剂

1.2.1 主要试剂和仪器

QIAGEN RNA提取试剂盒（基因公司），RT-PCR试剂盒与引物合成（武汉博士得生物工程有限公司），PCR仪 （德国 Biometra公司）；DNA Marker DL2000（大连 TaKaRa公司）。Control Primer：β-actin（532 bp）；Ang-1 基因 （312 bp） 引物：5′-TCCGGTGAATATTG GCTGGG-3′，5′-AAATCGCTGTCTGATCTTCTTCCAT-3′；Tie2 （512 bp）引物：5′-ATGGACTCTTTAGCCGGCTTA-3′，5′-CCTTATAGCCTGTCCTCGAA-3′。 总蛋白提取试剂盒SBS（Genetech公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，MERCK公司）；抗人Tie2酪氨酸磷酸化抗体、抗人β-actin抗体以及HPR标记的二抗均来自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.2 治疗方法

针对Ⅱ级和Ⅲ级高血压患者采取常规降压方案，主要包括β受体阻断剂、钙离子拮抗剂、阿司匹林以及他汀类药物，连续使用4周，所有患者治疗后血压均达到130/80 mm Hg以下。

1.2.3 Ang-1和Ti e2水平测定

所有研究对象入选前1周内未服用任何降压药和抗氧化剂，清晨分别抽取空腹外周血20 mL置入无菌肝素抗凝管内，加入Ficoll液4℃离心分离单个核细胞层并采用差速贴壁法纯化内皮祖细胞。

1.2.3.1 采用RT-PCR法测定Ang-1和Tie2 mRNA水平 分别提取各组内皮祖细胞总RNA，合成cDNA：加入总 RNA 2μg，oligo dT 1μL，RNA 逆转录酶 1μL，无RNA去离子水共20μL，轻轻混匀后，70℃变性5 min，42℃ 2 h，冰浴。分管进行Ang-1、Tie2和 β-actin基因PCR，95℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，30 个循环，72℃5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，通过图像分析仪进行灰度分析，分别测定Ang-1/β-actin以及Tie2/β-actin灰度比值。

1.2.3.2 采用Western-blot法测定Tie2酪氨酸磷酸化水平 分别提取各组内皮祖细胞总蛋白后取20μg，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃转膜12 h，蛋白封闭，加入抗Tie2酪氨酸磷酸化一抗、二抗，显影、压片。胶片经图像分析系统测得Tie2磷酸化/β-actin光密度比值反映体内活化Tie2受体表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组内皮祖细胞 Ang-1、Tie2 mRNA表达和Tie2酪氨酸磷酸化水平比较

本次实验结果显示，Ⅲ级高血压患者内皮祖细胞Ang-1和Tie2 mRNA表达分别显著低于Ⅱ、Ⅰ级高血压患者和对照组（P＜0.05）；Ⅱ级高血压患者内皮祖细胞Ang-1和Tie2 mRNA表达低于Ⅰ级高血压患者和对照组（P＜0.05）。内皮祖细胞内受体蛋白水平：Ⅲ级高血压患者活化Tie2水平明显低于Ⅱ、Ⅰ级高血压患者和对照组（P＜0.05）；Ⅱ级高血压患者Tie2磷酸化水平低于Ⅰ级高血压患者和对照组（P＜0.05）。对照组和Ⅰ级高血压患者内皮祖细胞内Ang-1、Tie2 mRNA表达以及Tie2磷酸化水平差异无统计学意义 （P＞0.05）。见表 1。

表1 各组内皮祖细胞Ang-1、Tie2 mRNA表达和Tie2酪氨酸磷酸化水平比较（x±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与高血压Ⅰ级比较，△P＜0.05；与高血压Ⅱ级比较，▲P＜0.05

2.2 治疗前后内皮祖细胞Ang-1和Tie2水平表达变化

Ⅱ级、Ⅲ级高血压患者经治疗后内皮祖细胞Ang-1和Tie2 mRNA表达均高于治疗前水平（P＜0.05）。治疗后内皮祖细胞Tie2酪氨酸磷酸化水平上调（P＜0.05）。见表2。

表2 治疗前后内皮祖细胞Ang-1、Tie2表达和Tie2酪氨酸磷酸化水平比较（x±s）

3 讨论

原发性高血压形成的高血流应切力可直接损伤血管内皮细胞。血压越高，损伤越大，越难以修复，进而发展为动脉粥样硬化、冠心病等严重合并症[5-7]。内皮祖细胞是具有增殖分化为血管内皮细胞的一类前体细胞，与新生血管生成、内皮细胞修复有关[8]。然而越来越多的研究发现[9-11]，高血压患者循环内皮祖细胞数量减低、功能障碍，内皮细胞得不到修复与更新，病情无法逆转。如何解释这一现象对于疾病的控制至关重要。

Tie2是一类酶联受体，广泛表达于内皮细胞及内皮祖细胞上，Ang-1、Ang-2是其主要配体，Ang-1能保持血管内皮的稳定性，促使血管成熟；Ang-2是Ang-1内源性拮抗剂，破坏血管的稳态。Ang-1与Tie2受体结合后酪氨酸残基被磷酸化进而发挥细胞的生物学功能[12-14]。内皮祖细胞修复内皮细胞的过程，很可能依赖Ang-1/Tie2信号通路精密调控，通路表达失衡可直接影响内皮祖细胞的动员和迁移，加速血管内皮的损伤及炎症过程[15-16]。内皮祖细胞上Ang-1/Tie2通路表达与高血压之间的关系目前国内鲜有研究。

本次实验结果显示，随着患者高血压分级的增高，内皮祖细胞Ang-1和Tie2 mRNA水平逐级降低，且具有生物活性的磷酸化Tie2水平也平行下调，表明信号通路的活性降低，血管内皮细胞的修复能力减弱，从而解释了内皮祖细胞数量下降及功能丧失的原因。同时也观察到，经过降压治疗后，Ang-1和Tie2的表达明显改善，说明高血压的因素去除之后，内皮细胞的修复活动增强，再次证实了内皮祖细胞依赖Ang-1/Tie2系统调控的推断。

此外，本研究也发现，高血压Ⅰ级患者的Ang-1和Tie2水平较之对照组并无明显差异，推测此阶段的内皮祖细胞仍具有较强的代偿能力，机体处于平衡状态，血压控制之后，发生心血管意外的概率明显低于其他两组。因此，内皮祖细胞Ang-1和Tie2表达也可作为预测血管功能和心血管危险度的指标之一[17-20]。

综上所述，内皮祖细胞Ang-1/Tie2的表达可能与高血压病血管损伤有密切关系，可通过Ang-1/Tie2表达的水平对患者的血管损伤程度和治疗效果进行判断，进而在临床上发挥重要作用。

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