不同产区与采收期黄柏中小檗碱与黄柏碱含量对比研究

李跃辉 胡薏冰 王 银 彭 宇 秦裕辉 黄慧勇 张水寒

1.湖南省中医药研究院 杨永华名老中医药专家传承工作室，湖南长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南长沙 410208

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，是临床常用的清热燥湿药，主治湿热泻痢、黄疸、热淋、湿疹症。黄柏习称“川黄柏”，分布于湖北、湖南西北部、云南、四川东部等地[1]，小檗碱、黄柏碱等是其主要药效成分，具有抗菌、消炎等药理作用[2-3]。目前，中药材市场存在问题较多，黄柏同种药材或饮片质量参次不齐，区域差异、种植的规范化及不按规律采收与加工炮制等[4]均在一定程度上影响药材的有效成分含量。试验收集了四川、云南、贵州、湖南等地不同时间采收的22批次黄柏药材，采用高效液相色谱（HPLC）法对其小檗碱、黄柏碱含量进行了检测[5]，以期为黄柏药材质量评价与资源合理利用提供试验数据与参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司）；KQ3200型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；T-214分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试药

药材分别采集于四川、云南、贵州等地产区，具体采收与来源见表1。黄皮树，经鉴定均为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮；小檗碱对照品（批号：110713-200911，供含量测定用）、盐酸黄柏碱对照品（批号：111895-201202，供含量测定用）均为中国药品生物制品检定所提供；水为重蒸馏水，乙腈、磷酸等试剂均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

表1 黄柏来源与采收时间表

2 方法与结果

2.1 小檗碱含量测定[6-8]

2.1.1 色谱条件 采用Lichrospher C18柱色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（含0.1%十二烷基磺酸钠），检测波长为265 nm，流速为1 mL/min，柱温为35℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加流动相配制成每毫升含100 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 各批样品粉碎过三号筛，取约0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加流动相90 mL，超声提取（功率 250 W，频率 40 kHz）40 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适用性试验 分别取上述溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于4000，小檗碱色谱峰与相邻峰之间分离度大于1.5。见图1。

2.1.5 线性关系 精密吸取上述对照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次进样，按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y＝41 604X-11 549，r＝0.9995。 线性范围为 0.25～2.00 μg。

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积积分值。结果RSD为1.28%，精密度＜2%。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取10 μL，分别于 0、3、6、9、12、15 h 进行测定， 记录峰面积，结果供试品溶液在15 h峰面积积分值基本稳定。

2.1.8 重复性试验 取同批次样品6份，按上述条件测定，结果药材中小檗碱平均含量为7.15%，RSD值为1.89%，表明本方法重复性好。

2.1.9 回收率试验 采用加样回收法。取已知小檗碱含量（7.15%）的黄柏药材6份，每份0.05 g，分别精密加入盐酸小檗碱对照品3.5 mg，按上述含量测定项下的方法测定，结果平均回收率为97.46%，RSD值为2.03%。

2.2 黄柏碱含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Lichrospher C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液 （含0.2%十二烷基磺酸钠）（36∶64），检测波长为 284 nm，流速为1 mL/min，柱温为35℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每毫升含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取各批次样品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入流动相25 mL，称定重量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再精密称重，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性试验 分别取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按盐酸黄柏碱峰计算不低于6000，盐酸黄柏碱色谱峰与相邻峰之间分离度大于1.5。见图2。

2.2.5 线性关系 精密吸取上述对照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次进样，按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y＝119 128X+31 320，r＝0.9999， 黄柏碱在0.2625～2.1000 μg范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积积分值。结果其峰面积积分值RSD为1.28%，符合要求。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取10 μL，分别于 0、3、6、9、12、15 h 进行测定，记录峰面积。 结果表明，黄柏碱在15 h内测定结果稳定。

2.2.8 重复性试验 取同批次样品，精密称取6份，按上述条件测定，结果药材中黄柏碱平均含量为0.64%，RSD值为1.76%，表明本方法重复性好。

2.2.9 回收率试验 采用加样回收法。取已知黄柏碱含量（0.64%）的黄柏药材6份，每份0.25 g，分别精密加入盐酸黄柏碱对照品1.6 mg，按上述含量测定项下的方法测定，结果平均回收率为96.89%，RSD值为2.25%。

2.3 样品测定

取各产地及各采收期样品，按照上述方法依次测定其小檗碱、黄柏碱的含量，结果见表2、3。

表2 不同产地黄柏药材中小檗碱、黄柏碱含量测定结果

表3 不同采收期黄柏药材中小檗碱、黄柏碱含量测定结果

3 讨论

3.1 样品采集

黄皮树有雌株与雄株之分，两者含量有一定的区别；另有报道黄柏药材于5～13年生黄皮树采收，以8～10年为最高，并以5月采收为最佳[9-10]。同时，黄柏采收有根皮、干皮、枝皮的区别，常规采用干皮入药[11]。为减小客观条件对小檗碱与黄柏碱含量的影响，本次样品采集均选择8年生黄皮树雌株干皮进行试验。

3.2 产地对含量的影响

试验研究结果表明，采收的10个产区黄柏药材其小檗碱与黄柏碱含量均达到了《中国药典》2010年版含量限度要求，不同产区含量有一定的差异，试验所收集的样品中，以湖南保靖县与花坛县为最高，四川荥经县与武隆县也较高，说明其含量高低与地域、栽培条件有一定的关系。文献报道，黄柏中小檗碱与黄柏碱含量多以四川地区产含量较高，也有报道贵州产含量较高[12]，此次试验研究中，以湖南产样品含量最高，产区保靖县夯沙乡与花坛县道二乡为新的黄柏种植基地，可能与当地环境气候及现代种植技术提高有关。

3.3 采收期对含量的影响

从不同采收期试验结果可看出，以小檗碱为考察指标，武隆县与保靖县黄柏药材含量均以5～6月上旬为最高，6月下旬含量开始下降，7、8月含量最低，9月份含量回升；以黄柏碱含量为考察指标，5～6月上旬为最高，7、8月含量稍低，相对基本稳定。说明黄柏宜在5～6月上旬采收为宜，此时小檗碱与黄柏碱含量均最高。本次试验收集批次样品有限，所测数据为各产区黄柏药材含量提供了参考，同时也为黄柏药材资源的合理利用提供了一定依据。

[1]沈力，付绍智，马羚，等.川黄柏野生资源调查研究[J].中国野生植物资源，2009，28（4）：25-27.

[2]廉莲，咸晓燕，楚东海，等.川黄柏的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：149-152.

[3]张博，张婷，王树春，等.黄柏的化学成分、质量分析方法及药理作用研究[J].现代医药卫生，2013，29（10）：1505-1507.

[4]邹美南，刘纪青，詹群英，等.不同产地黄柏浸出物的比较研究[J].中国医药科学，2012，2（20）：89-90.

[5]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：286.

[6]周敬，于天浩，陈平，等.HPLC法测定黄柏提取液中盐酸小檗碱含量[J].江西中医药，2013，356（4）：63-64.

[7]祝晨蔯，林朝展，莫建霞，等.HPLC法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量[J].中药新药与临床药理，2004，15（4）：262-264.

[8]李红英，向极钎，龙澜，等.HPLC法测定恩施黄柏药材中黄柏碱与小檗碱的含量[J].湖南民族学院学报，2013，31（1）：101-103.

[9]宋兵双，谢昭明.HPLC法对黄柏不同期采收药材不同部位的小檗碱含量比较研究[J].湖南中医药导报，2000，6（1）：38.

[10]李强.浅谈黄柏栽培技术[J].农村实用科技信息，2013，56（8）：20.

[11]孙雪梅，卢先明，邓晶晶，等.HPLC法测定黄柏不同部位中的盐酸小檗碱与盐酸药跟碱[J].华西药学杂志，2010，25（5）：599-600.

[12]徐敏，万德光.不同产地和生长年限川黄柏中小檗碱的含量测定[J].现代医药卫生，2007，23（1）：93.