小麦粉中虫卵的快速检测技术的研究与比较

刘凤杰 何向楠 王争艳 庄义捷 王文铎 郑学玲 鲁玉杰

（河南工业大学分析测试中心1，郑州 450002）

（河南工业大学粮油食品学院2，郑州 450002）

小麦粉中昆虫虫卵的检测在小麦粉的进出口贸易中，是一项重要指标，建立一种快速检测小麦粉中昆虫虫卵含量的方法是小麦粉产业中有待解决的问题[1]。

目前国内外对小麦粉中虫卵的检测主要用染色法[2-3]，浮选法[4]、尿酸法[5]、几丁质法[6]。浮选法已在美国AOCC中有详细说明，它是针对小麦粉中害虫碎片的检测，本研究用于虫卵的检测，判断其可行性。

尿酸是昆虫嘌呤代谢的主要终产物，为三氧基嘌呤，其醇式呈弱酸性，其合成是昆虫代谢途径的重要研究内容[7]。昆虫分泌的尿酸作为氮代谢的最终产物，已用于昆虫污染的指示物来检测籽粒及谷物产品中昆虫的数量[8]。几丁质（Chitin）是昆虫体壁主要化学成分，占表皮干重的20%～50%[9]。在高温和碱性条件下，几丁质脱去乙酰胺基形成几丁糖，而几丁糖经碘和稀酸作用后呈紫色。纯小麦粉中不存在几丁质，本试验根据该原理利用几丁质的检测方法来检测小麦粉中是否含有虫卵。染色法在生物科研领域应用较多且较为成熟，但在储藏物害虫虫卵的检测应用中尚处于初步研究试验中。研究表明对赤拟谷盗虫卵有明显染色效果的染色剂有溴甲酚绿、酸性品红、橙黄 G[2]。本试验利用溴甲酚绿、酸性品红作为主要染色剂对小麦粉中几种甲虫的卵进行了检测，比较检测的适用性、经济性和应用范围，试图找到一种快速、准确地判断小麦粉中虫卵的检测方法，以便在我国的小麦粉加工业推广应用。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

生化培养箱SPX-250B型：上海跃进医用光学器械厂；数显恒温磁力搅拌器HJ-3：国华电器有限公司；双目立体显微镜SZM45-B1：舜宇有限公司；高速冷冻离心机KDL-160HR：安徽中科中佳科学仪器有限公司；T6新世纪系列紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.2 试验材料

一级高筋粉：郑州金苑面业有限公司；石蜡油：上海生物工程股份有限公司；碘（粒状）、碘化钾、酸性品红指示剂：天津市科密欧化学试剂有限公司；溴甲酚绿指示剂：天津市瑞金特化学品有限公司

1.3 供试虫卵

选取小麦粉中常见害虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）作为虫卵来源。赤拟谷盗虫卵产生后带有黏液，裏上小麦粉等碎屑后体积增大，能存留在100目谷物筛上。

小麦粉经100目谷物筛过滤，以确保小麦粉干净。挑选体表干净、生命力强的赤拟谷盗，用过筛后小麦粉进行饲养并在生化培养箱中培养。经过24 h进行虫卵采集。虫卵暂存于培养皿中，待用。

1.4 检测方法

1.4.1 浮选法

由于首次采用浮选法检测小麦粉中的虫卵，所用虫卵数量较多，将 7、14、28、56、112粒虫卵分别放入5 g小麦粉中，每种虫卵3个重复，共15个样品，将小麦粉样品放在250 mL的烧杯中，加入90 mL 3%的盐酸溶液搅拌形成悬浊液，将混合物放在干燥箱中在121℃下干燥5 min。将混合液通过100目的滤网过滤，用自来水冲洗后转移到100 mL的烧杯中，加入7.5 mL的石蜡油，将混合液放在磁力搅拌器上高温搅拌5 min，然后将混合液转移到一个装满热水的250 mL烧杯中，趁热将溶液倒入250 mL分液漏斗中过滤，静置30 min，在静置的过程中间断性摇晃。排除底层3 cm左右，重复排除底层操作2～3次直至底层的物质被排除干净。将分液漏斗中的溶液倒入250 mL烧杯中，量取3%的盐酸溶液加到溶液中，然后将混合物放在磁力搅拌器上煮3～4 min。将混合液减压抽真空过滤，将滤纸上的虫卵转移到凹盘中用双目立体显微镜观察并计算数量，检测每5 g小麦粉中含有一定数量害虫虫卵的15个小麦粉试样中存在的害虫虫卵的数量。

1.4.2 尿酸检测法

FDA规定小麦粉虫体碎片禁售水平为50 g小麦粉中75个昆虫碎片，由于离心机及离心管规格所限，改进为0.5 g小麦粉中加入 1、3、5、7、9、11粒虫卵进行试验。分析天平称取18个0.5 g的小麦粉样品，然后按照改进加入不同数量的害虫虫卵放在小麦粉试样中，每个虫卵数量3个重复，混匀。

在6只试管中各加入含有1、3、5、7、9、11粒虫卵的0.5 g小麦粉，加入2 mL蒸馏水、1 mL 0.1%碳酸钠溶液；震荡，形成悬浊液。转移至离心管中，于10 000 r／min离心10 min，得到上清液。取上层清液0.5 mL加入另一离心管中，再加入4.5 mL钨酸试剂，混匀后静置5 min，重复所有测试组。将第二轮离心管于3 000 r／min离心5 min。另外制作标准管与空白管，将上清液换成0.3 mmol／L尿酸标准液与蒸馏水。再取8只离心管，各移入第二轮中离心管2.5mL上清液，并加入0.5mL 100 g／L碳酸钠溶液，混匀，室温静置10 min；加入0.5 mL磷钨酸应用液，混匀，置室温20 min。20 min后，用紫外分光光度计测定其吸光度[12]。

通过比较吸光度，按经验公式确定尿酸浓度。

测定组尿酸浓度（μmol／L）＝（测定组吸光度／标准组吸光度）×300

1.4.3 几丁质检测法

几丁质法首次应用于小麦粉中虫卵的检测，供试虫卵数量应较多，自备7、14、28、56、112粒虫卵，每种虫卵数量3个重复，共15个样品。

1.4.3.1 几丁质定性测定

消化管制备：取试管1支，配以橡皮塞，在橡皮塞上打1个直径约为5 mm的孔。插上玻璃管，橡皮塞外端的玻璃管上再连接1根橡皮管，长30～50 cm，橡皮管的另一端再接1根一端拉细的开口的玻璃管，并将开口的玻璃管通入水槽内，以防加热时碱液溅出。取虫卵适量，放入装有8 mL饱和氢氧化钾的试管中，塞紧带有橡皮管的橡皮塞，置于甘油浴中加热到160℃，保持15～20 min，由于虫卵的大部分组织在高温下被强碱消化，几丁质上乙酰基被脱去，得到透明薄膜状的几丁糖。

将各消化管内未消化的物质倒入小培养皿中，并用镊子将其逐步移入95%、70%、50%、30%的酒精溶液中清洗，再用蒸馏水冲洗待用。

取一块消化后的虫卵（几丁糖），置于白瓷点滴试验板上，加一滴0.03%碘—碘化钾溶液，再加一滴1%硫酸，几丁糖立即产生紫褐色反应。如再加上数滴75%硫酸稍待片刻，紫色变淡直至消失，表明几丁糖已在浓硫酸作用下完全水解。

1.4.3.2 几丁质定量测定

分别选取正常产出的虫卵，按设定取一定数量的虫卵分别在分析天平上称重。

将已知质量的虫卵分别放入消化管中，按1.4.3.1方法装入消化管，再加入5 g小麦粉混匀，在氢氧化钾饱和溶液中加热消化。

将消化后剩余的几丁糖薄膜细心地倒在滤纸上，用缓慢的流水冲洗干净，然后用95%、100%酒精脱水称重。

几丁质相对含量＝消化后虫卵（mg）／消化前虫卵（mg）×1.26×A×100%

转换系数A＝乙酰胺基葡萄糖分子质量／氨基葡萄糖分子质量

1.4.4 染色法

FAO规定小麦粉虫体碎片禁售水平为50 g小麦粉中含有小于或等于75个昆虫碎片，若将这个标准用于虫卵，按比例缩小，把 7、14、28、56、112粒虫卵分别加入5 g小麦粉，混匀，每个虫卵数量准备3个重复，共15个样品作为代检验样品。将完全混合后的的小麦粉样品用100＃筛网筛选并收集小麦粉残留物与虫卵，小麦粉颗粒包裹的虫卵转移到250 mL烧杯中，并用2～3 mL乙醇润湿，然后加入5 mL稀硫酸（1∶19）后盖上一培养皿，并保持10 min的蒸气浴，产物通过布氏漏斗低压抽滤。对于每一组，在无吸力的情况下加入10 mL染色剂（0.1%溴甲酚绿和0.05%酸性品红）：2～3 min后，通过轻微的吸力将染色剂透过滤纸。后将滤纸转移到培养皿中，用双目显微镜观察，统计卵数。

1.4.5 4种检测方法的验证

为了确定检测方法的准确度，分别从郑州金苑小麦粉厂和郑州海嘉小麦粉厂随机抽取了生产1周的特一粉和强筋小麦粉作为检测样品，在小麦粉袋的上、中、下部位进行扦样，每份60 g，均分成4份，每份再分成5 g的小份，每种方法3个重复，用浮选法、尿酸法、几丁质检测法和染色法4种方法检测小麦粉中有无虫卵。同时把取样的小麦粉放在人工培养箱中培养1个月，利用筛网人工检测小麦粉中幼虫的数量作为实际虫卵数。

2 结果与分析

2.1 浮选法检测结果的准确性

浮选法检测小麦粉中虫卵的数量与理论放置的虫卵的数量的相关性，如图1所示。浮选法检测小麦粉中虫卵的最高检测率仅为5.95%。

图1 浮选法检测虫卵数量与理论放置虫卵数的相关性分析

2.2 尿酸检测法检测结果的准确性

尿酸法检测尿酸浓度与小麦粉中虫卵数量的关系，如图2所示。从图2中可以看出，尿酸检测法能检测出小麦粉中不同虫卵量的尿酸浓度，且成正相关，相关系数为R2＝0.998 6。

图2 尿酸法检测尿酸浓度与虫卵数的相关性分析

2.3 几丁质检测法检测结果的准确性

2.3.1 几丁质定性

按照试验方法进行试验，能够观察到圆点状透明薄膜状的几丁糖漂浮在反应溶液上（图3）；按照试验方法进行几丁糖显色反应，可以明显观察到紫色絮状物生成（图4），可以认定虫卵中含有一定量的几丁质。

图3 透明薄膜状几丁糖

图4 几丁糖显色反应

2.3.2 几丁质定量

反应物于强碱环境中高温加热反应，生成橘红色黏稠物质，没有发现圆点状几丁糖薄膜；取生成物进行几丁糖显色反应，无紫色生成，说明几丁质被消化完。此方法不能进行定量试验，有待进一步探讨。

2.4 染色法检测结果的准确性

采用不同染料的染色结果有显著的区别，溴甲酚绿将虫卵染成黄橙色（图5），小麦粉染成褐绿色；酸性品红将虫卵与小麦粉染成紫色，虫卵外观近似透明，小麦粉相对颜色更深（图6）。

图5 利用溴甲酚绿染色剂对小麦粉中虫卵染色的效果

图6 利用酸性品红染色剂对小麦粉中虫卵染色的效果

不同的染料的颜色结果与理论虫卵数有一定的相关性，如图7所示。从图7中可知溴甲酚绿染色结果检测到的虫卵数与理论虫卵数的相关性回归方程为y＝0.86x-1.791 3相关系数R2＝0.999 6；酸性品红染色结果检测发现的虫卵数与实际虫卵数相关回归方程 y＝0.825 3x-3.615 8，相关系数 R2＝0.997 9。

图7 不同染色剂对小麦粉中虫卵染色结果与理论虫卵量的相关性分析

2.5 4种检测小麦粉中虫卵方法的比较

4种检测方法各有利弊，为了便于进一步研究，把不同方法的经济性、适用性和实用性等方面进行了比较分析，结果如表1所示。从表1可以看出，浮选法仅仅适用于昆虫碎片的检测，而不适合检测小麦粉中的卵。尿酸的检测方法成本较低，结果较为准确，可以应用于虫卵的分析。

表1 小麦粉中几种虫卵检测方法的比较

2.6 4种检测方法检测小麦粉中虫卵结果的比较

利用4种检测方法对2种不同生产厂家的小麦粉进行检测，并比较虫害培养1个月后的结果，如表2所示。从表2可以看出，4种检测方法中几种尿酸检测方法和染色法对小麦粉样品可以检测出来虫卵的含量，与1个月的培养结果相比，检出率分别达到73.3%和85%，说明尿酸检测方法和染色法可以初步用于小麦粉中虫卵的检测。

表2 4种检测方法检测随机小麦粉中虫卵的结果比较

3 讨论

研究了用于检测小麦粉中卵几种方法，其中染色法和浮选法（FAO）虽然有过相关的研究[2-4]，但本研究采用了不同的染色剂进行染色，并把用于检测害虫碎片的浮选法用于虫卵的检测。另外试验首次探索了利用害虫的排泄物尿酸的尿酸检测法和几丁质（昆虫体壁的特殊结构）检测方法进行小麦粉中卵的检测的方法。

结果表明，浮选法在检测小麦粉中的卵时，检测效果比较低（不到10%），且没有明显的规律。FAO规定的小麦粉中昆虫碎片的检测可以用浮选法进行，但根据本试验结果分析，并不适用于小麦粉中虫卵的检测。影响或误差原因可能包括：虫卵在3%盐酸中、经干燥箱121℃干燥加热5 min以及高温水浴都有可能造成虫卵解体或溶解，造成试验结果偏低；虫卵经筛网筛选过程中，可能夹藏在网眼或缝隙中，造成试验结果偏低；虫卵、水、石蜡油混合液在分液过程中可见虫卵因石蜡油粘在分液漏斗壁上，造成试验结果偏低。适用于昆虫碎片的检测方法，用于虫卵检测可能导致虫卵破碎，从而导致试验结果较低。

尿酸检测法中检测到虫卵尿酸的浓度随虫卵数增多而上升，成正相关。但增幅并不一致，造成该结果的原因可能包括：虫卵大小不一，尿酸含量可能不同；检测量较小，细微的小麦粉质量差别或试剂剂量差别可能导致最终结果出现误差。从验证的结果看该方法还需要进一步的改进。几丁质检测方法通过检测几丁糖从而确定虫卵所含几丁质的量，这种试验方法需要进一步研究，目前不宜用于小麦粉中虫卵的检测。

染色方法中2种染色剂的染色效果接近，但都存在一定的误差。染色法可将小麦粉和虫卵染成不同的颜色，便于对比统计。但因为需要经过筛网过滤，对于虫卵直径有较高要求；对于已知害虫种类的虫卵，可以精确筛网尺寸，但对于不明确害虫种类的虫卵，筛网尺寸难以确定，进而导致检测过程困难或检测结果有较大偏差。染色法可以用于小麦粉中常见虫卵检测，但难以普及至全部害虫虫卵的检测。

4 结论

浮选法可导致虫卵破损和遗失，造成试验结果显著偏低，即浮选法不适用于虫卵的检测。

几丁质检测法只能对虫卵含有的几丁质定性，但不能定量，所以此法不易用于小麦粉中虫卵的检测，需要进一步研究；尿酸检测法表明虫卵尿酸浓度与虫卵数成正相关，最低限能检测到1 kg小麦粉中含有100粒虫卵，尿酸检测法可初步应用于小麦粉中虫卵的检测，但需要进一步研究；溴甲酚绿和酸性品红染色剂可以将虫卵与小麦粉染成不同的颜色，染色法可以初步用于小麦粉中常见害虫虫卵的检测，但需要进一步找到染色效果更加合适的染色剂。

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