不同方法测定花生花粉活力的比较研究

王金花，张健琴，成良强，吕建伟，胡廷会，饶庆琳，姜 敏，王 军

(1.贵州省农业科学院油料研究所，贵阳 550006； 2.安顺学院，贵州 安顺 561000)

花生(ArachishypogaeaL.)是重要的油料作物和经济作物，我国花生产量和单产均位居世界第一位，在保障国家油料供给安全、推进农业结构调整中具有重要作用[1-3]。杂交育种是我国培育花生新品种的主要手段之一[4]，但花生杂交授粉成功率相对较低，在授粉之前检验花粉的生活力,掌握不同花生品种的花粉生活力,对于提高杂交育种授粉效率、合理进行杂交育种具有重要意义[5]。近年来，对于其他作物花粉活力检测方法的研究较多，例如，通关藤[6]、思茅松[7]适合用I2-KI染色法，马蹄莲[8]、玉米[9]适合用TTC染色法，细香葱[10]适合用联苯胺染色法，但是关于花生花粉活力测定方法的报道较少。本试验利用TTC染色法、卡宝品红染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法、红墨水染色法以及离体萌发法等6种方法对花育23、四粒红、吉花23进行花粉活力测定，通过不同测定方法的比较分析，筛选出适合花生花粉活力快速检测的方法，为花生杂交育种提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验采用吉花23、花育23及四粒红等3个花生品种，试验材料种植于贵州省农业科学院试验基地，2021年6月24日播种，进行常规田间管理，于盛花期，选择晴天07：00—08：00时采集盛开的花蕾，带回实验室取花粉进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1TTC染色法

在离心管中滴入1～2滴0.4%的TTC溶液，使花粉散在溶液中，将离心管置于35 ℃恒温箱中放置1.5 h，取出后用移液枪吸取花粉悬浮液于载玻片上，镜检，有活力的花粉呈红色，有微弱活力的花粉呈淡红色，无活力或不育的花粉无色。

1.2.2卡宝品红染色法

滴1～2滴卡宝品红溶液于载玻片上，取少许花粉，搅拌均匀后盖上盖玻片，染色5～10 min，镜检，有活力的花粉被染成紫红色，浅红色的活力次之，未被染色或者无变化的花粉不具有活力。

1.2.3醋酸洋红染色法

滴1～2滴1%的醋酸洋红溶液于载玻片上，取少许花粉，搅拌均匀后盖上盖玻片，染色5～10 min，镜检，具有活力的花粉被染成红色，无活力的花粉不被染色。

1.2.4I2-KI染色法

配制0.5% I2+2% KI溶液，贮于棕色瓶中，滴1～2滴I2-KI溶液于载玻片上，取少许花粉，搅拌均匀后盖上盖玻片，染色5～10 min，镜检，有活力的花粉呈红棕色，无活力的花粉呈黄褐色。

1.2.5红墨水染色法

配制5%的红墨水溶液，滴1～2滴于载玻片上，取少许花粉，搅拌均匀后盖上盖玻片，立刻镜检，有活力的花粉不被染色，无活力的花粉被染成红色。

1.2.6离体萌发法

配制花粉萌发培养基(15%蔗糖+0.5%硼酸+1%琼脂，pH值5.8～6.2)，放在4 ℃冰箱保存备用，用镊子将花粉涂抹在预先准备好的培养基上，做好标记后，将培养皿置于28 ℃恒温箱中培养，培养1.5 h后在显微镜下观察花粉萌发的情况，以花粉管长度超过花粉直径作为萌发标准，统计花粉萌发率：

萌发率(%)=(已萌发的花粉粒数/总花粉粒数)×100%。

1.3 数据统计

每个处理制作3个玻片，在OLYMPUS-IX 83倒置显微镜下观察并拍照，每个玻片选取5个视野，统计花粉粒总数量不少于500个，计算花生花粉活力：

花粉活力(%)=(有活力的花粉数量/总花粉数量)×100%。

1.4 数据处理

所得试验数据采用Excel 2016和SPSS 26.0 软件进行处理。

2 试验结果

2.1 TTC染色法

TTC染色法对花生花粉的染色效果见图1 A，TTC染色液处理后，所有的花粉呈黄褐色，未观察到被染成红色的花粉，花粉活力测定结果均为0，说明TTC染色法不易使花生花粉着色，因此，不适合用来测定花生花粉活力。

2.2 卡宝品红染色法

卡宝品红染色法对花生花粉的染色效果见图1 B，所有的花粉都被染色，大部分花粉被染成紫红色，少数畸形花粉被染成浅紫色，花粉活力检测结果均为100%。因此，利用卡宝品红染色法不能辨别出花生花粉是否具有活力，不适合花生花粉活力的测定。

2.3 醋酸洋红染色法

醋酸洋红染色法对花生花粉活力的染色效果见图1 C，几乎所有的花生花粉都被染成红色，少数畸形花粉未被染色。醋酸洋红染色法测得的3个花生品种的花粉活力分别为97.31%、93.80%和97.56%，3个品种的平均值为96.20%，最小值为76.92%，最大值为100.00%(见表1)。该方法测定结果偏高，不适合花生花粉活力的测定。

表1 醋酸洋红染色法检测花生花粉活力统计结果Table 1 Statical results of peanut pollen vitality detected by acetic acid magenta solution staining

2.4 I2-KI染色法

I2-KI染色法对花生花粉活力的染色效果见图1 D，有活力的花粉淀粉含量高，被染成红棕色，而无活力的花粉淀粉含量低，不被染色，呈黄褐色。I2-KI染色法测得的3个花生品种的花粉活力分别为84.88%、91.68%和87.99%，平均值为88.19%，最小值为73.91%，最大值为98.89%(见表2)。I2-KI染色法染色速度快，操作简单，有活力的花粉与无活力的花粉差异明显，适合用于测定花生花粉活力。

表2 I2-KI染色法检测花生花粉活力统计结果Table 2 Statical results of peanut pollen vitality detected by I2-KI staining

2.5 红墨水染色法

红墨水染色法对花生花粉活力的染色效果见图1E，有活力的花粉其细胞膜具有选择透性，不能被红墨水染色，无活力的花粉具有完全渗透性，被染成红色。红墨水染色法测得的3个花生品种的花粉活力分别为64.29%、63.86%和64.30%，平均值为64.15%，最小值为40.74%，最大值为81.48%(见表3)。红墨水染色法染色速度快，操作简单，有活力的花粉与无活力的花粉差异明显，适合用于测定花生花粉活力。

表3 红墨水染色法检测花生花粉活力统计结果Table 3 Statical results of peanut pollen vitality detected by red ink staining

2.6 离体萌发法

花生花粉在萌发培养基上的萌发情况见图1 F，3个花生品种的花粉萌发率分别为60.50%、57.49%和57.90%，平均值为58.47%，最小值40.00%，最大值80.00%(见表4)。离体萌发法能直观地反映花粉萌发情况，测定结果相对准确，但该方法对于培养温度、营养成分、pH值要求较高，花费时间较长。

表4 离体萌发法检测花生花粉活力统计结果Table 4 Statical results of peanut pollen vitality detected by in vitro germination method

2.7 不同花粉活力测定方法的比较

TTC染色法不能使花生花粉着色，所测的花粉活力值均为0，因此未进行花粉活力比较分析。由表5可知，不同方法测定的花粉活力值差异较大，其大小关系为：卡宝品红染色法>醋酸洋红染色法>I2-KI染色法>红墨水染色法>离体萌发法；差异显著性分析结果表明，5种方法间存在极显著差异，卡宝品红染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法测定结果显著高于红墨水染色法和离体萌发法(p<0.05)；在花育23和吉花23中，卡宝品红染色法与醋酸洋红染色法测定结果差异不显著，两者均显著高于I2-KI染色法的测定结果，在四粒红中，卡宝品红染色法测定结果显著高于醋酸洋红染色法和I2-KI染色法，而醋酸洋红染色法和I2-KI染色法测定结果差异不显著；红墨水染色法的测定结果最接近离体萌发法，在花育23和吉花23中，红墨水染色法与离体萌发法的测定结果在p<0.05水平上差异不显著，而在四粒红中，红墨水染色法与离体萌发法的测定结果在p<0.01水平上差异不显著(表5)。

表5 花生花粉活力不同测定方法的结果比较Table 5 Comparison of determination methods of peanut pollen vitality

注：A为TTC染色法；B为卡宝品红染色法；C为醋酸洋红染色法；D为I2-KI染色法；E为红墨水染色法；F为离体萌发法。 图1 不同方法检测花生花粉活力镜检结果Fig.1 Microscopic examination results of peanut pollen vitality detected by different methods

3 讨论与结论

离体萌发法可以直接观测到花粉的萌发情况，本试验中，3个花生品种的花粉均能较好地萌发，并且萌发率基本稳定，是花粉活力测定的首选方法，这与在马蹄金[11]、卵叶海桑[12]中的研究结果是一致的，但是该方法操作复杂，花费时间长，不适合花粉活力的快速检测。染色法具有快速简便的优点，能够在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影响较大，不同植物适用不同的染色法[13]，本研究中，红墨水染色法染色效果好，操作简单，且测定结果最接近离体萌发法，是快速测定花生花粉活力最适合的方法，在王伟伟等[14]的研究中，蓝墨水染色法是快速测定柳树花粉活力最合适的方法。红墨水染色法的测定原理是有活力的花粉其细胞膜具有选择透性，不能被红墨水染色，无活力的花粉具有完全渗透性，被染成红色，但随着染色时间的延长，多数花粉会失去选择透性，这与任飞艳等[12]的研究结果一致，因此在使用该方法时操作要迅速，染色后立即拿到显微镜下观察。

I2-KI染色法是靠淀粉使花粉着色，染色效果除了受淀粉含量的影响外，还受支链淀粉和直链淀粉比例高低的影响[15]，直链淀粉与碘的结合物呈蓝色, 支链淀粉与碘的结合物呈紫色[16]，多数情况下，I2-KI溶液将有活力的花粉染成蓝色或蓝黑色，例如，通关藤[6]、思茅松[7]、牡丹[17]和芍药[18]，少数研究中I2-KI溶液可将有活力的花粉染成红棕色，如滇重楼[19]，本研究中，有活力的花生花粉粒着红棕色，说明花生花粉内淀粉主要为支链淀粉，此外，I2-KI染色法对花生花粉染色效果明显，有活力花粉和无活力花粉容易区分，是较好的花生花粉活力测定方法，但测定结果显著高于离体萌发法(p<0.05)。

醋酸洋红溶液和卡宝品红染色法测定结果显著高于其他测定方法。醋酸洋红溶液几乎使所有的花生花粉着色，少数畸形花粉未着色，这与醋酸洋红溶液对柱花草的染色效果相似[20]；而卡宝品红染色法使所有的花粉均着色，大部分花粉被染成紫红色，个别花粉被染成浅紫色，而在岳玲等[21]的研究中，卡宝品红染色法是适宜君子兰花粉活力测定的方法，与本试验结果差别较大，具体原因有待进一步研究。

TTC染色法是靠呼吸作用产生的NADH2或NADPH2使花粉着色,在花粉活力测定中具有广泛的应用，例如，钝裂银莲花[22]、毛叶铁线莲[23]、黄牡丹[24]都适合用TTC染色法，而在本试验中，TTC染色法对花生花粉的染色效果不佳，未能观测到被染成红色的花粉粒，有研究表明，TTC染色法也不能使毛棉杜鹃花[25]、锦带[26]、肉果秤锤树[27]、君子兰[21]的花粉着色，可能是因为花粉外壁太厚或者花粉呼吸产生的脱氢酶较少，具体原因还有待进一步研究。

综上所述，离体萌发法是检测花生花粉活力最准确有效的方法，TTC染色法、卡宝品红染色法和醋酸洋红染色法不适合花生花粉活力的测定；I2-KI染色法和红墨水染色法操作简单、染色效果明显，是较好的花生花粉活力快速检测方法,其中，红墨水染色法的测定结果与离体萌发法的测定结果最接近，是最适合用于花生花粉活力快速检测的方法。