女性系统性红斑狼疮患者雌激素受体的表达

周 卫，蔡 燕，刘青松，蒋 红，邢 艳

(1.川北医学院2008 级硕士研究生，四川 南充 637000;2.四川中医药高等专科学校临床医学系，四川 绵阳 621000;3.川北医学院医学检验系，附属医院检验科，四川 南充 637000;4.川北医学院风湿免疫研究所，四川 南充 637000 )

本刊网址:http://www.nsmc.edu.cn 作者投稿系统:http://noth.cbpt.cnki.net 邮箱:xuebao@nsmc.edu.cn

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种与多种因素相关的自身免疫性疾病，病变累及多系统、多器官，其病因及发病机制尚未完全明确。很早人们就观察到女性更易罹患该病，并且月经周期、妊娠、避孕药对SLE 的疾病状态有着明显影响，活动的SLE 血清中E2可增高［1］，其代谢产物如2-羟雌酮、16-α 羟雌酮也存在比例失衡［2］，性激素尤其雌激素在SLE 的发生发展中具有重要作用［3］。本研究通过检测SLE 患者PBMCs 中ERα、ERβ 的表达率，探讨ER 亚型与SLE 的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取我院2009 年12 月至2010 年6 月住院及门诊SLE 女性患者46 例，其诊断均符合1982 年美国风湿病协会修订的红斑狼疮诊断标准，平均年龄(36.1 ± 12.4)岁。健康体检者33 例，平均年龄(37.8 ±13.9)岁，入选者均无其他风湿性、内分泌性和代谢性疾病。

1.2 主要试剂和仪器

TRIZOL 试剂、2 × Taq PCR MasterMix(北京天根生物技术有限公司)，焦碳酸二乙酯处理水(Sigma 公司)，逆转录试剂盒(成都博瑞克生物技术有限公司)，兔抗人ERα、ERβ(Santa 公司)，荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥，进口分装)，PCR 仪、凝胶成像仪、电泳仪(Bio-Rad 公司)，荧光显微镜(Olympus 公司)。

1.3 ER 基因水平的检测

1.3.1 RNA 的提取及cDNA 的合成 取肝素抗凝的外周静脉血4 mL，用Ficoll 密度梯度离心法分离PBMCs。TRIZOL 法提取细胞总RNA。cDNA 合成按照逆转录试剂盒说明书进行。

1.3.2 PCR 反应 总体积为25 μL:cDNA 模板为4 μL，2 ×MasterMix 12.5 μL，双蒸水7.5 μL，上下游引物各0.5 μL。反应条件为94 ℃预变性10 min;94 ℃变性45 s，ERα 62 ℃退火45 s，ERβ 60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环45 次;末次循环72 ℃5 min。引物由上海生物工程公司合成，ERα 引物:sense 5’-atcctgatgattgttctcgtct-3’，antisence 5’-ggatatggtccttctcttccaga-3’，扩增产物长度为271 bp;ERβ 引物:sense 5’-gctcatctttgctccagatcttg-3’，antisence 5’-caatcacccaaaccaaagcatc-3’，扩增产物长度为266 bp。以管家基因β-actin 作为内参，引物分别为:sense 5’-gagctacgagctgcctgacg-3’，antisence 5’-gtagtttcgtggatgccacag-3’，产物长度为120 bp。

1.3.3 PCR 扩增产物电泳 取6 μL PCR 产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳20 min，结果用凝胶成像系统扫描，出现肉眼可辨的清晰条带为阳性。

1.4 ER 蛋白水平的检测

1.4.1 制备细胞甩片 取肝素抗凝的外周静脉血2 mL，用Ficoll 密度梯度离心法常规分离PBMCs，将细胞悬液密度调整为1 ×10－6，制备细胞甩片，待自然干燥后，用4%多聚甲醛固定，－30 ℃保存备用。

1.4.2 免疫荧光法检测PBMCs 中ER 的表达 取出冻存的细胞甩片，室温复温1 h，PBS 缓冲液洗3次，每次5 min;0.5%triton 溶液37℃透膜25 min，再洗3 次;在37 ℃用3%BSA、5%脱脂奶粉各封闭30 min，加1∶100 稀释的兔抗人ERα、ERβ 在4 ℃孵育过夜。次日复温30 min，缓冲液洗3 次，FITC 标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育40 min，洗3 次，甘油封片后在荧光显微镜下观察，抗体均用3%BSA 按1∶100 稀释。

1.4.3 结果判定 细胞无荧光为阴性，呈黄绿色或亮绿色荧光为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件，χ2检验及确切概率法分析，检验水准α=0.05。

2 结果

雌激素受体在PBMCs 中的表达类型有3 种:同时表达ERα 和ERβ(ERα +ERβ)，只表达ERα，只表达ERβ。

2.1 PBMCs 中ER mRNA 的表达

经1.5% 琼脂糖电泳，β-actin、ERβ、ERα PCR产物均得到明显而单一的条带，如图1 所示。

图1 M 为DNA Marker （100~600 bp），梯度为100 bp，Lane1-lane3 分别为SLE 患者PBMCs 内β-actin、ERβ、ERα 产物

RT-PCR 检测到SLE 组和对照组PBMCs 中ERα mRNA、ERβ mRNA、(ERα mRNA + ERβ mRNA)和阴性表达的例数见表1。

表1 SLE 组与对照组ER mRNA 表达比较

统计分析显示，SLE 组和正常对照组PBMCs 中ER mRNA 的表达没有显著差异(P ＞0.05)。

2.2 PBMCs 中ER 在蛋白水平的表达

间接免疫荧光法检测到SLE 组ERs 阳性表达35 例，阴性11 例;对照组ERs 阳性表达21 例，阴性12 例。如图2 ～4 所示。

图2 SLE 患者PBMCs 内ERs 表达阴性

图3 SLE 患者PBMCs 内ERα 表达阳性

图4 SLE 患者PBMCs 内ERβ 表达阳性

SLE 组和对照组PBMCs 中ERα、ERβ 蛋白表达情况，见表2。卡方检验结果显示，SLE 组和正常对照组ER 在蛋白水平的表达无显著性差异(P ＞0.05)。

表2 SLE 组与对照组ER 蛋白表达比较

3 讨论

SLE 好发于女性且疾病活动度随女性生理周期、妊娠而变化，说明性激素及其受体在SLE 的发生发展中有着重要作用。目前普遍认为雄激素是天然的免疫抑制剂，而雌激素是体液免疫增强剂。雌激素是一种类固醇激素，与多个系统的发育有关，其中雌二醇(estradiol，E2)的作用尤为重要。

雌激素的靶细胞可以是T、B 淋巴细胞、NK 细胞、单核－巨噬细胞、树突状细胞等，这些细胞参与SLE 的病理过程。雌激素通过与靶细胞的受体结合发挥生理效应，ER 包括雌激素核受体和膜表面相关受体。雌激素核受体属于类固醇激素核受体超家族，目前发现有ERα、ERβ 两种亚型［4］，它们由不同的基因编码，具有不同的组织特异性，其中ERβ 具有更为广泛的组织分布［5］。它们可以共表达亦可单独表达，更多是呈共表达并形成功能性的同型二聚体和异二聚体，形成异二聚体尤甚。共表达时ERβ 显现出抑制由ERα 介导的效应，多发挥与ERα 相反的作用，如抑制脂肪减少、子宫细胞增殖。同型二聚体和异二聚体同时存在时，异二聚体的生物学作用尚不清楚［6］。膜表面相关受体的结构和功能尚不清楚，有人认为与ERα 相似。

研究表明，雌激素及其受体在SLE 的病理过程中发挥着重要作用，而这种作用与受体的类型相关。动物实验表明，ERα 基因缺陷的NZM2410 狼疮倾向雌性小鼠与野生型小鼠相比，有较长的生存率，蛋白尿、肾脏病理分级和血尿素氮水平更低，ERα 基因缺陷的MRL/lpr 的雌性小鼠同样也有较低的蛋白尿、肾脏病理学分级，但与体内抗体水平没有相关性。而无论是品种和性别，ERβ 基因缺陷对病情没有影响［7］。Feng 等［8］的两项动物实验也表明E2通过ERα 对狼疮表型的诱导发挥重要作用。可见，ERα 与SLE 的关系较为密切。最近有研究者做了敲除ERα 基因的相关实验，他们发现，敲除ERα 基因的狼疮倾向鼠比未敲除鼠有更低浓度的蛋白尿和更轻微的肾脏疾病，且其存活期更长;敲除ERα 基因的雌性鼠，其B 细胞经Toll-样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂处理后显著降低了炎症反应;敲除ERα 基因的鼠脾细胞比野生型鼠脾细胞干扰素调节因子-5(interferon regulatory factor 5，IRF5)(一种狼疮倾向因子)表达更低［9－10］。

本研究分别采用RT-PCR 法和免疫荧光法检测PBMCs 中ER 阳性表达细胞，结果发现，在基因和蛋白水平上，SLE 患者组和对照组之间ER 表达率均没有显著性差异。我们的结果与Suenaga 等［11］采用Scatchard 分析法的结果一致，表明ER 亚型在表达率上没有差异。而Inui 等［12］分离SLE 外周血单个核细胞，采用RQ-PCR 检测ERα mRNA 和ERβ mRNA 的表达，发现ERα mRNA 表达水平增加，ERβ mRNA 表达水平降低。说明ER 在表达量上有改变。这种表达量的差异或许与SLE 的发生发展相关，这有待于通过一些深入研究予以证实。Lin等［13］比较分析了20 例女性SLE 患者和6 例女性健康对照的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)中ERα 和T 细胞活化基因——钙调神经磷酸酶在基因和蛋白水平的表达，发现SLE 患者ERα mRNA 和蛋白显著增高，经雌激素处理后钙调神经磷酸酶浓度升高，且SLE 患者组比对照组高3.15 倍，证明ERα 过表达后活化钙调神经磷酸酶，可能与SLE 的病理过程相关。因此我们推测某些因素可能通过某种途径诱导ER mRNA 表达量发生变化，从而参与SLE 的发生发展。

虽然已经明确雌激素及受体参与SLE 的病理过程，但其作用机制和发挥效应的途径并不十分清楚。因此，深入研究SLE 病理状态下ER 信号通路和下游信号分子将是探索雌激素对SLE 作用机制的重要途径。

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