Eag1 钾离子通道、HIF-1α 以及VEGF 在子宫颈癌中的表达及其临床意义

刘 邦，刘 钧，蹇顺海，黄一凡，韩颖苹，付秋娟，聂 佳

(1.仪陇县人民医院肿瘤科，四川 仪陇 637641;2.川北医学院附属医院病理科，四川 南充 637000)

本刊网址:http://www.nsmc.edu.cn 作者投稿系统:http://noth.cbpt.cnki.net 邮箱:xuebao@nsmc.edu.cn

近年来研究表明，钾离子通道是细胞膜上重要的离子通道，并参与肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，可以为肿瘤治疗提供新的靶点［1］。其中Eag1(ether à go-go，Eag1)钾离子通道是研究相对较多的一种，Eag1 通道在其细胞内部分存在一个氧感受器(PAS)区，肿瘤细胞在生长过程中发生缺氧时，Eag1通道表达增高，并且在低氧环境下诱导低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的大量转录，产生糖酵解增加及血管生成增多等一系列低氧适应反应，从而使肿瘤细胞在缺氧环境中继续生长发展［2］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最关键的血管生成调节因子，可以增加血管通透性，抑制血管内皮细胞凋亡并刺激其增殖，从而促使血管生成，促进肿瘤生长。Eag1、HIF-1α、VEGF 均与肿瘤发生发展密切相关，但三者联合检查尚未见报道。本文采用免疫组化方法检测慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宫颈鳞癌组织中Eag1、HIF-1α 及VEGF 的表达情况，分析三者与宫颈鳞癌临床病理特征的关系，并分析Eag1、HIF-1α 及VEGF 的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集川北医学院附属医院病理科2006 年6 月至2012 年6 月经病理确诊病例的石蜡蜡块，其中慢性炎症宫颈组织40 例，CIN 40 例(其中CINⅠ～Ⅱ20 例，CINⅢ20 例)，宫颈鳞癌100 例。100 例宫颈鳞癌均为手术切除标本，均有完整临床病理资料，其中50 例术前先接受放射治疗，年龄33 ～65 岁，平均年龄49 岁。按照世界卫生组织(WHO，2003)子宫颈癌组织学分类标准，角化型47 例，非角化型45例，其他类型宫颈鳞癌8 例;伴有淋巴结转移34 例，无淋巴结转移66 例。临床分期根据国际妇产科联盟(FIGO，2009)宫颈癌分期标准，由妇科医生根据临床检查确定临床分期，早期宫颈癌即Ⅰ～Ⅱa 期63 例;中晚期宫颈癌Ⅱb 及Ⅱb 期以上37 例。

1.2 实验方法及试剂

Eag1 兔抗人多克隆抗体和HIF-1α 兔抗人多克隆抗体均购自北京雷根生物技术有限公司(中国)，VEGF 兔抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司(中国)。将原病例常规石蜡包埋的蜡块，作4 μm 连续切片4 张，分别作HE 染色，Eag1、HIF-1α 和VEGF 免疫组化染色(SP 法)。免疫组化染色各步骤均按试剂盒说明书严格操作。已知阳性切片为阳性对照，以PBS 代替一抗为阴性对照。

1.3 判断标准

Eag1 为光镜下细胞质或细胞膜内染成棕黄色者为阳性表达(图1);HIF-1α 为光镜下以肿瘤细胞核内或胞质有棕黄色细颗粒者为阳性表达(图2);VEGF 为光镜下以肿瘤细胞胞质内有棕黄色细颗粒者为阳性表达(图3)。双盲法观察切片，采用半定量积分法进行分级［3］，每张切片随机选择具有代表性的10 个高倍镜视野(×400)进行计数，每个视野计数100 个细胞，共计1 000 个细胞，计算阳性细胞数与细胞总数的百分率，分级如下:不论其染色强弱如何，阳性细胞少于或等于10%计为0 分;阳性细胞为11% ～30%，计为1 分;阳性细胞为31% ～75%，计为3 分，＞75%为3 分;根据细胞染色强度分级如下:无色为0 分，浅黄色为1 分，黄色为2 分，棕黄色为3 分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≤1 分为阴性，1 ～2 分为弱阳(+)，2 ～4 分为阳性(+ +)，＞4 分为强阳(+ + +)。若两人判断结果相差2 分则重新判定。

图1 Eag1 在宫颈癌中的表达（SP×200）

图2 HIF-1α 在宫颈癌中的表达（SP×200）

图3 VEGF 在宫颈癌中的表达（SP×200）

1.4 统计学分析

应用SPSS19.0 软件，采用χ2检验，方差分析及Spearman 等级相关分析方法进行统计分析，以P ＜0.05 表示结果具有统计学意义，P ＜0.01 表示结果具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 Eag1、HIF-1α 和VEGT 在不同病变宫颈组织中的表达

从表1 可知，Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表达在CIN、宫颈鳞癌均显著增加，均具有统计学意义(P ＜0.01)。

表1 Eag1、HIF-1α 和VEGT 在不同病变宫颈组织中的表达

2.2 Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表达与宫颈癌临床病理特点

从表2 可知，Eag1、HIF-1α 及VEGF 阳性表达率在非角化型鳞癌中高于角化型、Ⅱb 及以上期高于Ⅰ～Ⅱa 期、伴有淋巴结转移者明显升高，均具有统计学意义(P ＜0.05)。

表2 Eag1、HIF-1α 和VEGT 的表达与临床病理特点

2.3 Eag1、HIF-1α 和VEGT 蛋白在放射治疗前后的表达

从表3 可知，放疗前Eag1、HIF-1α 及VEGF 阳性表达率较放射治疗后阳性表达率明显下降，两者比较有统计学意义(P ＜0.05)。

2.4 宫颈鳞癌中Eag1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表达的相关性

从表4 可知，子宫颈鳞癌组织中Eag1 蛋白与HIF-1α 蛋白的表达(r =0.291)及VEGF(r =0.297)蛋白的表达均呈正相关(均为P ＜0.01)。子宫颈鳞癌组织中HIF-1α 蛋白与VEGF 蛋白的表达呈正相关(r=0.294，P ＜0.01)。因此，Eag1、HIF-1α 与VEGF三者在宫颈癌组织中的表达呈正相关性。

表4 宫颈鳞癌组织中Eag1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表达的相关性

3 讨论

3.1 Eag1 在宫颈不同病变组织中的表达及其临床意义

在人类，Eag 家族被发现有8 个成员，而成员之一Eag1(Kv10.1，KCNH1)钾通道被认为是Eag 家族中与恶性肿瘤关系最为密切的钾通道之一［4］。在正常组织中Eag1 钾离子通道蛋白主要存在于脑组织，在胎盘和成肌细胞中也有少量表达［5］。在多种上皮性肿瘤组织中钾通道蛋白均有高表达，如肝癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢囊腺癌、甲状腺乳头状癌、支气管癌等［6］。

本实验显示宫颈鳞癌组织中Eag1 蛋白的阳性表达率高于CIN 组和宫颈慢性炎症组，CIN 组Eag1蛋白的阳性表达率高于宫颈慢性炎症组。Eag1 蛋白的表达率在非角化型宫颈鳞癌高于角化型鳞癌，晚期宫颈癌(Ⅱb 及Ⅱb 期以上)高于中早期宫颈癌(Ⅰ～Ⅱa 期)，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移，并且随着病变程度的加重，Eag1 表达逐渐增高。提示Eag1 钾通道蛋白的表达在宫颈癌发生发展过程中起十分重要的作用，并且与宫颈癌的临床分期、淋巴结是否转移密切相关，该结果与林爽等［7］研究结果一致。实验中我们还发现Eag1 的表达与宫颈癌组织学类型也有密切关系，该结论与现有报道不太一致，有待进一步增加病例数充实该项结论。

研究中，还选择了50 例放射治疗前后标本对比观察Eag1 的表达情况，结果发现放疗前Eag1 的阳性表达率高于放疗后。进一步观察时发现，5 例在放疗前Eag1 呈弱阳性表达的患者，完成放射治疗后，经手术切除的标本中，仅见少量癌残留，可见明显炎症反应和坏死。而强阳性表达的患者放疗后癌组织均残存较多。Eag1 在恶性肿瘤组织放疗前后的表达情况尚未见报道，初步分析放疗后Eag1 表达减少的原因可能是:①经过放射治疗后肿瘤细胞抗原发生丢失，造成Eag1 表达减少;②放射后癌组织体积缩小甚至不见癌残留，从而影响阳性表达;③放射过程中会使宫颈组织中的微血管和淋巴管发生闭塞，造成肿瘤坏死组织增多，从而影响Eag1 的表达。我们认为，Eag1 的表达与放疗效果之间存在相关性，癌组织中低表达者对放射治疗敏感，放疗效果好于高表达者，原因可能是Eag1 的高表达会促使HIF 转录增多，促使血管生成增多，使肿瘤组织适应缺氧环境，增加肿瘤内部乏氧区域，造成放射抵抗，影响放射治疗效果。林爽等［8］应用钾通道阻断剂四氨基吡啶(4-amino-pyridine，4-AP)研究宫颈癌Hela 细胞时发现，4-AP 能增加宫颈癌细胞对中子照射的敏感性。分析认为4-AP 能明显降低HIF-1α 表达，降低HIF-1α 高表达所致的肿瘤低氧性放疗抵抗。进一步说明Eag1 的表达与肿瘤治疗密切相关，有望成为肿瘤靶向治疗的靶点。

3.2 HIF-1α 在宫颈不同病变组织中的表达及其临床意义

缺氧诱导因子(HIF-1)是人体细胞发生缺氧应答时的关键性调控因子，在缺氧状态下，HIF-1α 会在缺氧信号的刺激下大量转录，且转录出的HIF-1蛋白表达稳定，进而促进一系列缺氧反应基因的转录，进而促进多种缺氧适应蛋白的合成，促进肿瘤细胞生长、浸润和转移［9-10］。

本研究显示宫颈鳞癌组织中HIF-1α 蛋白的阳性表达率高于CIN 组和宫颈慢性炎症组，CIN 组HIF-1α 蛋白的阳性表达率高于宫颈慢性炎症。进一步分析发现宫颈癌病理分化程度愈低、临床分期得愈晚以及有淋巴结转移者，HIF-1α 蛋白的阳性表达率表达愈高。这与结肠癌、胃癌的研究结果相似［11-12］。结果提示随着宫颈病变的进展，缺氧程度不断加重，肿瘤细胞内HIF-1α 浓度增加，促使相关靶基因转录，促使宫颈癌病变进展。50 例宫颈癌放疗前HIF-1α 阳性表达率是48%，放疗后为22.8%，放疗后明显下降，具有统计学意义(P ＜0.05)，再进一步观察发现，5 例放疗前HIF-1α 呈弱阳性表达的患者，经过放疗后手术标本中，仅见少量癌细胞残留，提示HIF-1α 的表达与放疗效果之间存在相关性，癌组织中低表达者对放射治疗敏感，放疗效果好于高表达者，这与宋娜莎［13］研究结果类似。

3.3 VEGF 在宫颈不同病变组织中的表达及其临床意义

VEGF 是诱导肿瘤产生新生血管的关键因子之一。黄一凡等［14］在应用实时荧光定量(PCR)和免疫组化法检测结肠癌组织及正常结肠组织中VEGFmRNA 及VEGF 蛋白的表达情况时发现，VEGF 蛋白的表达与结肠癌发生、淋巴结转移、组织学分类及Dukes 分期呈正相关(P ＜0.05)。

本实验研究显示宫颈鳞癌组织中VEGF 蛋白的阳性表达率高于CIN 组和宫颈慢性炎症组，CIN 组VEGF 蛋白的阳性表达率高于宫颈慢性炎症。非角化型鳞癌中VEGF 的表达高于角化型鳞癌，早期宫颈癌(Ⅰ～Ⅱa 期)VEGF 蛋白表达率低于晚期宫颈癌(Ⅱb 及Ⅱb 期以上)，在淋巴结转移组中VEGF蛋白的表达明显高于无淋巴结转移组。说明VEGF在宫颈癌的生长发展，侵袭过程中起着重要作用，与子宫颈癌的侵袭、转移及患者预后不良有密切联系。

放疗前宫颈鳞癌VEGF 的阳性表达率是56%，放疗后降为24%，放疗前VEGF 阳性表达率明显高于放疗后。提示VEGF 在宫颈鳞癌放射治疗过程中发挥重要的作用，可作为宫颈鳞癌放射治疗疗效的预测指标之一。

3.4 Eag1、HIF-1α、VEGF 在宫颈不同病变组织中表达的相关性

从表1 -4 中可知，Eag1、HIF-1α、VEGF 三者均随宫颈鳞癌的进展而表达增高，并且三者呈正相关表达。我们推测在宫颈鳞癌的生长发展过程中，Eag1 钾离子通道的激活与肿瘤的缺氧状态和血管生成密切相关。肿瘤组织在体积增大到一定程度后中央区域必然会发生缺氧［15］，Eag1 钾离子通道感受到肿瘤细胞缺氧信息后将低氧信息传递到细胞核内，激活HIF-1α 基因的表达，在肿瘤细胞内产生大量的HIF-1α，过多的HIF-1α 蛋白又进一步促进VEGF 蛋白的表达增多，Eag1、HIF-1α，VEGF 大量表达的结果是为肿瘤细胞的持续增生提供营养，促进肿瘤细胞增殖，肿瘤体积增大。

综上所述，我们认为Eag1、HIF-1α、VEGF 联合检查可作为宫颈鳞癌早期诊断、判断肿瘤浸润进展和预后的指标，有望成为宫颈鳞癌患者的治疗新靶点。

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