微小RNA-199a-5p调控大鼠心肌细胞肥大的研究*

张振辉， 黎 佼， 熊旭明， 陈伟燕， 刘世明△

(广州医科大学附属第二医院1重症医学科，2心血管内科，广州心血管疾病研究所，广东广州 510260)

微小RNA-199a-5p调控大鼠心肌细胞肥大的研究*

张振辉1， 黎 佼2， 熊旭明1， 陈伟燕1， 刘世明2△

(广州医科大学附属第二医院1重症医学科，2心血管内科，广州心血管疾病研究所，广东广州 510260)

目的：探讨微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)在心肌肥大模型中的表达及对大鼠心肌细胞肥大的调控作用。方法：用腹主动脉缩窄术(TAAC)构建心肌肥大大鼠模型，体外培养新生Sprague-Dawley大鼠心肌细胞，用血管紧张素II(Ang II)诱导心肌细胞肥大，荧光定量PCR(qRT-PCR)检测动物血浆和心肌细胞miR-199a-5p含量;合成大鼠miR-199a-5p的拟似物(mimic)和抑制剂(inhibitor)，用脂质体转染mimic和inhibitor进入心肌细胞，用qRT-PCR检测肥大基因心房钠尿因子和β-肌球蛋白重链mRNA的表达变化;用氚标亮氨酸掺入量检测细胞蛋白合成速率变化;用细胞荧光染色法检测细胞表面积变化。结果：TAAC术后28 d，大鼠血浆miR-199a-5p的含量较对照组显著增加(P＜0.05)，在Ang II诱导肥大的心肌细胞中，miR-199a-5p的表达量也较对照组显著增加。在心肌细胞中过表达miR-199a-5p，能使细胞肥大基因表达增加，蛋白合成速率加快，细胞表面积增大，而使用inhibitor阻遏miR-199a-5p的作用后，能抑制Ang II诱导的肥大基因表达、细胞蛋白合成速率和细胞表面积的变化。结论：心肌肥大动物和细胞模型中miR-199a-5p的表达发生上调。过表达miR-199a-5p能促进体外培养的心肌细胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。

微小RNA;心肌肥大;血管紧张素II

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约19～25 nt的单链非编码RNA分子。miRNAs通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期发育，细胞增殖、凋亡和分化等［1-3］。近年的研究发现，心肌肥大/心力衰竭等多种心脏疾病的发病受miRNA的调控［4-6］。本研究组通过腹主动脉缩窄术(transverse abdominal aortic constriction，TAAC)建立压力过负荷性心肌肥大模型，发现心肌肥大大鼠血浆中的microRNA-199a-5p(miR-199a-5p)升高明显。目前关于miR-199a-5p对心肌肥大的调控作用仍缺乏报道。本研究通过体外培养心肌细胞，在细胞内过表达或抑制miR-199a-5p，观察其对心肌细胞肥大的影响，现将结果报道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 试剂和仪器 DMEM细胞培养基、Opti-MEM细胞转染培养基、胎牛血清和0.25%胰酶购自Gibco;细胞转染试剂Lipofectamine RNAiMAX、RNA抽提裂解液Trizol和SYBR Green qPCR荧光定量PCR试剂盒均购自 Invitrogen;5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)购自Sigma。［3H］-亮氨酸、闪烁液和闪烁瓶购自Perkin Elmer。液体闪烁计数器(Tri-Carb 2900TR)，荧光定量PCR仪(ABI7500)，激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)。

1.2 实验分组 将动物实验分为假手术组(sham组)和手术组(TAAC组)。将细胞分为对照(control，Con)组、AngⅡ组、miR-199a-5p拟似物的阴性对照(negative control，NC)组、miR-199a-5p拟似物转染组(miR-199a-5p组)、miR-199a-5p抑制剂阴性对照(inhibitor negative control，INC)组、INC+AngⅡ组(先转染INC，再加AngⅡ作用)和anti-miR-199a-5p +AngⅡ组 (先转染miR-199a-5p的inhibitor，再加AngⅡ作用)。

2 方法

2.1 Wistar大鼠心肌肥大动物模型的制备 采用TAAC方法建立压力过负荷心肌肥大大鼠模型。SPF级Wistar大鼠16只(购于广东省实验动物中心)，体重(100±10)g，随机分为sham组(n=8)和TAAC组(n=8)。造模前8 h禁食不禁水。3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射，麻醉固定后，常规消毒，腹部正中切口，打开腹腔，逐层分离，于左肾动脉上方分离腹主动脉，在左肾动脉以上0.5 cm处，用4.0丝线绕穿该处腹主动脉，将预先弯曲好的5号针头(外径0.5 mm)置于拟缩窄处的腹主动脉旁，丝线将其与腹主动脉一起结扎，之后将针头抽出，造成腹主动脉部分缩窄，假手术组仅分离出腹主动脉而不行缩窄术。至第28天心脏采血收集动物血标本，模型制备和验证参考文献报道［7］。

2.2 原代心室肌细胞(cardiomyocytes，CM)的分离、培养 新生1～2 d Sprague-Dawley大鼠(购于广东省实验动物中心)常规乙醇消毒，剪开胸腔，超净工作台中无菌条件下取心尖部，将心室组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm碎片后用0.25%胰蛋白酶37℃水浴分次消化。采用差速贴壁原理分离CM，调整细胞密度为3×108/L，接种于细胞培养板中培养。前48 h加BrdU 0.1 mmol/L。培养至第4天后去血清培养过夜，第5天的细胞用于实验［8］。

2.3 寡核苷酸序列设计与合成 大鼠miR-199a-5p的拟似物(mimic)根据其成熟体序列(miRBase accession No.MIMAT0000872)合成，为双链结构;miR-199a-5p的抑制剂(inhibitor)则采用miR-199a-5p成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行2’-甲氧基修饰(由吉玛公司设计)，为单链结构。双链RNA的阴性对照(NC)和单链RNA的阴性对照(INC)为非哺乳动物基因组的同源性序列，由吉玛公司设计和合成。PCR引物由上海英骏生物公司合成，见表1。

2.4 AngⅡ诱导乳鼠原代CM肥大 按照方法2.2分离培养CM，加入1 μmol/L AngⅡ培养的CM(等量超纯水作为对照)，无血清DMEM培养基培养48 h后收集细胞检测。

2.5 细胞转染 miRNA的转染使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX，按说明书操作，miRNA终浓度为100 nmol/L。最后一次转染的48 h或72 h后按实验需要处理细胞。

2.6 大鼠血浆样本和CM总RNA的提取及qRTPCR检测 动物血浆样本经方法2.1步骤分离获得后，每份取330 μL，加入670 μL Trizol试剂，用氯仿、异丙醇、75%乙醇分离、沉淀、清洗RNA，质检、定量。按Trizol试剂盒说明书的操作步骤提取培养的贴壁CM的总RNA;按逆转录反应试剂盒说明书进行逆转录反应(16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min)，反应产物进行PCR扩增;PCR过程按qPCR试剂盒说明书在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行。PCR反应条件:95℃ 3 min;45个PCR循环(95℃15 s，60℃20 s，72℃20 s，78℃20 s)。miRNA使用U6作为内参照，mRNA使用18S作为内参照同时进行PCR，获得Ct值后，应用比较Ct法进行相对定量，目标基因的相对定量按2-ΔΔCt计算。

2.7 氚标亮氨酸掺入法(［3H］-Leu incorporation)检测CM蛋白合成速率 CM培养于24孔板中，培养和转染条件同上，收集前12 h每孔加入氚标亮氨酸3.7×104Bq，收集细胞时先去掉培养液，PBS漂洗后加入30%过氧化氢和高氯酸(2∶1配制混合液)，80℃孵育1 h裂解细胞，收集裂解液转移至含闪烁液的 闪烁瓶中，液闪仪检测氚的放射性计数。

表1DNA和RNA寡核苷酸序列Table 1.The sequence of the oligonucleotides

2.8 心肌细胞表面积大小的检测(荧光染料染色法) 采用携带荧光基团的染料鬼笔环肽(fluorescent phallotoxins)，按说明书操作，染心肌细胞骨架蛋白F-actinin，DAPI染核，激光共聚焦显微镜拍摄心肌细胞轮廓，进而计算细胞的表面积大小，结果用IPP 6.0软件分析。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间差异只有两组时用t检验，有多组时用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 心肌肥大模型中miR-199a-5p表达上调

采用TAAC方法制备大鼠心肌细胞肥大动物模型成功后，取动物血浆用qRT-PCR方法检测miR-199a-5p的表达变化，结果显示，TAAC组大鼠血浆miR-199a-5p的表达水平较sham组明显升高(P＜0.05)。AngⅡ刺激CM 48 h，结果显示，AngⅡ组CM miR-199a-5p的表达水平也较Con组明显升高(P＜0.05)，提示miR-199a-5p在心肌细胞肥大动物模型和细胞模型中均表达上调。

Figure 1.Up-regulation of mature miR-199a-5p expression in cardiac hypertrophy models.miRNA expression levels were measured using qRT-PCR.Mature miR-199a-5p was up-regulated in the plasma(A)of TAAC group (n=8)and Ang II-induced cardiomyocytes(B，n= 3).Mean±SEM.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs Con group.图1 心肌肥大模型中miR-199a-5p的表达上调

2 过表达miR-199a-5p促进CM肥大

转染 miR-199a-5p的 mimic，在 CM内过表达miR-199a-5p后，qRT-PCR方法检测肥大基因心房钠尿因子(atrial natriuretic factor，ANF)和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)mRMA的表达量;氚标亮氨酸掺入量检测细胞蛋白合成速率的变化;荧光染料染色法检测心肌细胞表面积大小变化。结果如图2显示，与NC组比较，过表达miR-199a-5p后能使肥大基因ANF和β-MHC的表达量增加，CM合成速率加快，CM表面积增大(均P＜0.05)。

Figure 2.Over-expression of miR-199a-5p promoted cardiomyocyte hypertrophy.The mRNA expression levels of ANF and β-MHC were measured by qRT-PCR(A).The protein synthesis rate were measured by leucine incorporation assay(B).Cardiomyocytes were stained with Alexa Fluor 546 phalloidin and 4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole.A blind observation was examined more than 200 cells from randomly acquired images.The relative cell area images were analyzed using Image-Pro Plus 6.0 software(C).Scale bar=50 μm.Mean±SEM.n=3.#P＜0.05 vs NC group.图2 过表达miR-199a-5p对CM肥大的作用

3 阻遏miR-199a-5p能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大

转染miR-199a-5p的inhibitor或INC，再用AngⅡ刺激心肌细胞，qRT-PCR方法检测ANF和β-MHC mRMA的表达量;氚标亮氨酸掺入量检测细胞蛋白合成速率的变化;荧光染料染色法检测心肌细胞表面积大小变化。结果如图3显示，在转染miR-199a-5p INC后，AngⅡ同样能刺激心肌细胞肥大(使ANF和β-MHC mRMA的表达量增加，CM合成速率加快，CM表面积加大);但先转染miR-199a-5p的 inhibitor，使细胞内miR-199a-5p作用受阻后，再用AngⅡ刺激CM，则CM不再出现肥大(均P＜0.05)，提示阻遏miR-199a-5p的作用，能抑制AngⅡ诱导心肌细胞肥大。

讨论

近年来的文献报道显示，在心肌肥大动物模型中，miRNAs的表达谱发生明显改变，在心肌肥大的调控中起重要作用，并指出miRNAs可能会成为逆转心肌肥大甚至治疗心衰的新靶标。其中van Rooij等［6］报道，用主动脉缩窄术或过表达钙调神经磷酸酶诱导小鼠发生心脏肥大后，心肌组织中至少有12个miRNAs表达上调或下调，并发现其中多个miRNAs的变化与心衰患者心脏组织中的变化相一致。在体外培养的心肌细胞中诱导miRNAs过表达可直接导致细胞肥大，另外，过表达miR-195的转基因小鼠最终发生心衰。van Rooij等［9］的研究结果认为miR-208是心脏肥大、纤维化所必需的，miR-208缺失的小鼠，应激诱导时不产生心脏重构和β-MHC的表达上调，而miR-208超表达的转基因小鼠则出现明显的β-MHC的表达上调。Sayed等［10］的小鼠TAAC模型中，术后第14天，心脏组织miR-26a和miR-26b出现表达下调。以上研究报道证实miRNAs在心肌肥大病理过程中发挥重要作用。

Figure 3.The effects of repressing miR-199a-5p on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy.The mRNA expression levels of ANF and β-MHC were measured by qRT-PCR(A).The protein synthesis rate were measured by leucine incorporation assay (B).Cardiomyocytes were stained with Alexa Fluor 546 phalloidin and 4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole.A blind observation was examined more than 200 cells from randomly acquired images.The relative cell area images were analyzed by using Image-Pro Plus 6.0 software(C).The cardiomyocytes were transfected with INC or miR-199a-5p inhibitor，and 24 h later，AngⅡwas added and co-incubated for 48 h.Mean±SEM.n=3.△P＜0.05 vs INC group;#P＜0.05 vs INC+AngⅡgroup.Scale bar=50 μm.图3 抑制miR-199a-5p对AngⅡ诱导CM细胞肥大的影响

Chen等［11］的研究结果显示，组织器官表达的miRNA，可以释放至人的血清和血浆中，并可以用qPCR的方法检测到，同时发现血清中的miRNA能够抵抗RNA酶A的消化，这种现象使得miRNA很有希望成为临床诊断肿瘤和其它疾病的无创性生物标记物被广泛应用。另外，研究还发现，在镰状细胞性贫血、前列腺癌、肺癌和心肌损伤等疾病中，循环miRNA均发生明显的表达变化［12-14］，Tijsen等［15］则发现miR-423-5p在心衰患者的血液循环中表达明显升高，而且与正常人对照和其它疾病导致的呼吸困难患者对照均有差异，认为可以把它当作心衰患者的循环生物标记物。本实验也做了相关的尝试，通过qRT-PCR的方法检测 TAAC大鼠血浆中miR-199a-5p的含量，发现其较sham组明显升高。进而我们通过Ang II诱导体外培养的乳鼠心肌细胞建立心肌肥大细胞模型，检测细胞内miR-199a-5p的表达变化，结果发现Ang II诱导组miR-199a-5p的表达也较对照组显著升高，与心肌肥大动物模型血浆中miR-199a-5p的含量变化相一致，证明miR-199a-5p在心肌肥大过程中变化显著。

化学合成的miRNA拟似物miRNA mimics(双链寡核苷酸)借助脂质体介导进入细胞内，能够达到在细胞内过表达miRNA，进而抑制靶基因的目的;导入miRNA的抑制剂(miRNA的反义寡核苷酸，或者称为antagomirs)则能抑制 miRNA的作用［16-17］。我们通过转染miR-199a-5p的拟似物(mimic)进入乳鼠心肌细胞以过表达miR-199a-5p，发现心肌细胞的肥大基因表达上调，细胞蛋白合成速率加快，特别是细胞形态学的结果显示，过表达组心肌细胞表面积较对照组明显增大，证明miR-199a-5p的过表达能促进体外培养的心肌细胞肥大。接着，我们通过转染miR-199a-5p的抑制剂进入 CM，阻遏心肌细胞内源性miR-199a-5p的作用，再用Ang II诱导心肌细胞肥大，结果发现，Ang II不能再像对照组一样诱导心肌细胞肥大，证明阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大，也提示Ang II诱导的心肌细胞肥大可能受miR-199a-5p的调控。miRNA通常通过与靶基因的结合，抑制或降解靶基因的mRNA，实现转录后水平的负调控［18-19］。关于miR-199a-5p的作用靶点，我们通过生物信息学软件(Targetscan，PicTar)预测和查阅文献报道［20］，发现miR-199a-5p的靶点可能有缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)，HIF-1α和GSK-3β均可参与心肌肥大的调控［20-21］，其具体调控机制有待进一步探讨。

综上所述，心肌肥大动物和细胞模型中 miR-199a-5p的表达发生上调，在体外培养的心肌细胞中过表达miR-199a-5p能促进心肌细胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。研究结果为进一步完善心肌肥大的调控机制和miRNA作为循环生物标记物的临床应用提供了实验依据。

［1］Pasquinelli AE.MicroRNAs:deviants no longer［J］.Trends Genet，2002，18(4):171-173.

［2］Brennecke J，Hipfner DR，Stark A，et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila［J］.Cell，2003，113(1):25-36.

［3］Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation［J］.Science，2004，303(5654):83-86.

［4］Zhao Y，Samal E，Srivastava D.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis［J］.Nature，2005，436(7048):214-220.

［5］Thum T，Galuppo P，Wolf C，et al.MicroRNAs in the human heart:a clue to fetal gene reprogramming in heart failure［J］.Circulation，2007，116(3):258-267.

［6］van Rooij E，Sutherland LB，Liu N，et al.A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(48):18255-18260.

［7］Zhang ZH，Li J，Liu BR，et al.MicroRNA-26 was decreased in rat cardiac hypertrophy model and may be a promising therapeutic target［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2013，62(3):312-319.

［8］张振辉，尤祥宇，刘少军，等.MicroRNA-29a对大鼠心肌细胞 Bcl-2和 Mcl-1表达的调控作用及其机制［J］.中国病理生理杂志，2012，28(11):1928-1932.

［9］van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA［J］.Science，2007，316(5824):575-579.

［10］Sayed D，Hong C，Chen IY，et al.MicroRNAs play an essential role in the development of cardiac hypertrophy［J］.Circ Res，2007，100(3):416-424.

［11］Chen X，Ba Y，Ma L，et a1.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10): 997-1006.

［12］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30): 10513-10518.

［13］Ai J，Zhang R，Li Y，et al.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1):73-77.

［14］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury［J］.Clin Chem，2009，55 (11):1944-1949.

［15］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al.MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure［J］.Circ Res，2010，106(6):1035-1039.

［16］Xiao J，Yang B，Lin H，et al.Novel approaches for genespecific interference via manipulating actions of micro-RNAs:examination on the pacemaker channel genes HCN2 and HCN4［J］.J Cell Physiol，2007，212(2): 285-292.

［17］Wang Z，Luo X，Lu Y，et al.miRNAs at the heart of the matter［J］.J Mol Med，2008，86(7):771-783.

［18］Eulalio A，Rehwinkel J，Stricker M，et al.Target-specific requirements forenhancersofdecappingin miRNA-mediated gene silencing［J］.Genes Dev，2007，21(20): 2558-2570.

［19］Stark A，Brennecke J，Bushati N，et al.Animal micro-RNAs confer robustness to gene expression and have a significant impact on 3＇UTR evolution［J］.Cell，2005，123 (6):1133-1146.

［20］Rane S，He M，Sayed D，et al.Downregulation of miR-199a derepresses hypoxia-inducible factor-1α and Sirtuin 1 and recapitulates hypoxia preconditioning in cardiac myocytes［J］.Circ Res，2009，104(7):879-886.

［21］Antos CL，McKinsey TA，Frey N，et al.Activated glycogen synthase-3β suppresses cardiac hypertrophy in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(2):907-912.

Regulatory effect of miR-199a-5p on cardiomyocyte hypertrophy in rat

ZHANG Zhen-hui1，LI Jiao2，XIONG Xu-ming1，CHEN Wei-yan1，LIU Shi-ming2
(1Intensive Care Unit，2Department of Cardiovascular Medicine，Guangzhou Institute of Cardiovascular Diseases，The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM:To investigate the expression of miR-199a-5p in rat cardiomyocyte hypertrophy models.METHODS:The in vivo cardiomyocyte hypertrophy model was established by transverse abdominal aortic constriction (TAAC)and the in vitro model was induced by angiotensin II.The content of miR-199a-5p was detected by qRT-PCR in the plasma of the TAAC rats and in the cardiomyocytes(CM)of the newborn rats.The CM was isolated and transfected with miR-199a-5p mimic or inhibitor at concentration of 100 nmol/L by Lipofectamine RNAiMAX.The mRNA levels of atrial natriuretic factor(ANF)and β-myosin heavy chain(β-MHC)were detected by qRT-PCR.Tritium-labeled leucine incorporation was employed to determine the protein synthesis rate in the CM.The method of cyto-fluorescent staining was applied to measure the changes of the CM surface area.RESULTS:Compared with control group，the content of miR-199a-5p significantly increased in the TAAC rats and in the CM induced by angiotensin II.In addition，over-expression of miR-199a-5p in the CM up-regulated the mRNA expression of ANF and β-MHC，accelerated the protein synthesis rate and enlarged the CM surface area.In the CM transfected with miR-199a-5p inhibitor following induced by angiotensin II，the hypertrophy effect receded inversely(P＜0.05).CONCLUSION:Over-expression of miR-199a-5p may promote cardiomyocyte hypertrophy，and repression of miR-199a-5p may inhibit cardiomyocyte hypertrophy in the CM.

MicroRNAs;Myocardial hypertrophy;Angiotensin II

R541.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.005

1000-4718(2014)03-0408-06

2013-11-14

2014-01-22

国家自然科学基金青年项目(No.81201453);广东省自然科学基金资助项目(No.S2013010014887);广州市属

高校科研项目(No.2012C230)

△通讯作者Tel:020-34152381;E-mail:gzliushiming@126.com