超抗原葡萄球菌肠毒素A拮抗伊马替尼抑制T细胞活化作用的研究*

颜宇辉， 陈小华， 王冠明， 林 晨△， 李扬秋

(暨南大学1医学院微生物与免疫学系，2血液研究所，广东广州 510632)

超抗原葡萄球菌肠毒素A拮抗伊马替尼抑制T细胞活化作用的研究*

颜宇辉1， 陈小华1， 王冠明1， 林 晨1△， 李扬秋2

(暨南大学1医学院微生物与免疫学系，2血液研究所，广东广州 510632)

目的：探讨葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)对甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate，IM)抑制T淋巴细胞活化的影响。方法：2 mg/L SEA和50 nmol/L IM联合作用于Jurkat细胞24 h后，用实时荧光定量PCR技术检测CD3ε和ζ链mRNA表达水平变化;Western blotting技术检测CD3ε和ζ链蛋白水平变化。结果：单纯IM组CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达均表现下调;SEA与IM联合用药组可以逆转IM下调CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达水平作用。SEA拮抗IM抑制作用中，对CD3ε链mRNA表达上调的作用明显大于CD3ζ链。结论：SEA能拮抗IM对T细胞CD3ε和ζ链表达的抑制作用。

超抗原;葡萄球菌肠毒素A;伊马替尼;T淋巴细胞;抗原，CD3

材料和方法

1 材料

金黄色葡萄球菌肠毒素A(Sigma);伊马替尼(Selleck Chemicals);Cell Counting Kit-8 CCK-8;(日本同仁化学研究所);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);Trizol试剂(北京康为世纪生物有限公司)。逆转录试剂盒和Real Master Mix试剂盒(日本东洋纺)。Jurkat细胞来源于暨南大学血液病研究所。

2 方法

2.1 IM对Jurkat细胞浓度的选择 培养体系如下: Jurkat细胞1.0×109/L，含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液，1×105U/L青霉素，100 mg/L链霉素。各孔分别加入50、100、200和300 nmol/L IM，对照孔加RPMI-1640培养液，设置空白孔，每孔做3复孔，放置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。培养结束时，每个实验孔内加入10 μL CCK-8试剂后，再继续培养4 h，用双波长测定吸光度(A)，检测波长为450 nm，参比波长为600 nm。各组抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)。

2.2 SEA联合IM与Jurkat细胞培养 分4组:2 mg/L SEA组、50 nmol/L IM组、SEA+IM联合组和对照组。将状态良好的 Jurkat细胞调节为浓度为1.0×109/L，接种于12孔板中，分别加入相应浓度的SEA与IM，总体积1.5 mL，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

2.3 实时荧光定量PCR 采用Trizol试剂处理样品细胞，氯仿、异丙醇常规提取RNA，合成cDNA链，利用SYBR Green I染料检测各样本的CD3ε和ζ链mRNA表达情况，并将β2M作为内参照，采用相对定量法分析各组CD3ε和ζ链mRNA表达水平的差异［3］。根据文献［5］设计CD3ζ链序列引物 (ACCESSION No.J04132)。CD3ζ链上游引物5＇-GCC AGA ACC AGC TCT ATA AC-3＇，下游引物5＇-TAG GCC TCC GCC ATC TTA TC-3＇，扩增目的片段长度166 bp。根据CD3ε链的序列设计引物(ACCESSION No.NM_000f733)［3］。扩增 CD3ε链上游引物5＇-TCC CAA CCC AGA CTA TGA GC-3＇，下游引物5＇-CAA GAC TAG CCC AGG AAA CAG-3＇，扩增目的片段的长度为158 bp。β2M上游引物5＇-TAC ACT GAA TTC ACC CCC AC-3＇，下游引物5＇-CAT CCA ATC CAA ATG CGG CA-3＇，扩增目的片段长度145 bp。

总反应体积为20 μL，包括Real Master Mix 10 μL，0.5 mmol/L上、下游引物，1 μL cDNA，8 μL蒸馏水。在95℃、1 min预变性后，共进行40个循环扩增，每一循环包括95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s。并在72℃读板1次。随后，以0.15℃/s变化速度从65℃到95℃每隔1 s记录1次荧光值，获得熔解曲线。反应在MJ Research DNA Engine Opticon 2荧光定量PCR仪(Bio-Rad)中进行。

以β2M为内参照，利用Ct值计算各组CD3ε链和ζ链表达的相对量。并用相对定量公式:2-ΔΔCt计算诱导组与空白对照组CD3ε链和ζ链的表达差异，其中ΔΔCt=ΔCt(诱导组)-ΔCt(对照组)，ΔCt=Ct (ζ/ε)-Ct(β2M)，而基因差异表达的倍数即为2-ΔΔCt。

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2.4 Western blotting Jurkat细胞分4组:2 mg/L SEA组、50 nmol/L IM组、SEA+IM联合组和对照组。24 h后收集细胞，加60 μL细胞裂解液，混匀，冰上裂解30 min，每隔10 min振荡1次，4℃12 000 ×g离心10 min，取上清，与5×上样液4∶1混合，沸水浴10 min，-20℃保存。BCA法测定样品蛋白浓度，等量蛋白30 μg 10%SDS-PAGE，用半干转方式将蛋白转移到PVDF膜上，将膜在含5%脱脂奶粉TBST中室温封闭1 h，TBST洗3次，每次5 min。放入Ⅰ抗4℃过夜，TBST洗3次，每次5 min，将膜放入Ⅱ抗，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL显色。目的条带用ImageJ分析软件进行灰度值分析，以GAPDH内参照进行校正。

3 统计学处理

利用SPSS 16.0软件对数据分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 IM对Jurkat细胞增殖影响

不同浓度IM作用于Jurkat细胞24 h，CCK-8测定其对细胞增殖抑制作用的影响。结果显示随着IM浓度的增加，IM对Jurkat细胞的抑制逐渐增加，见图1。

Figure 1.The effects of different concentrations of IM on the proliferation of Jurkat cells after 24 h.Mean±SD.n=3.图1 不同浓度IM作用Jurkat细胞24 h对其增殖的影响

2 PCR产物鉴定

β2M、CD3ε和CD3ζ熔解曲线均只有单一峰，特异性良好，见图2。

Figure 2. Real-time fluorescence quantitative PCR melting curves of β2M，CD3ε and CD3ζ。图2 实时荧光定量PCR测定β2M、CD3ε和CD3ζ的熔解曲线

3 SEA、IM及SEA+IM对Jurkat细胞CD 3ε和ζ链mRNA表达的影响

根据实时定量PCR的相对定量公式计算基因表达异常倍数值，2-ΔΔCt＞1表明表达量增高，2-ΔΔCt＜1表明表达量降低。单纯SEA(2 mg/L)作用于Jurkat细胞，CD3ε和ζ链mRNA表达水平明显上调;单纯IM(50 nmol/L)作用，CD3ε和CD3ζ链mRNA表达水平明显下调;而在SEA+IM作用下，与同组IM组比较，被抑制的CD3ε和ζ链mRNA表达水平得以逆转(P＜0.05);并且，SEA+IM对CD3ε链mRNA表达影响明显强于对CD3ζ链mRNA表达水平影响(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.Effects of SEA，IM and SEA+IM on the mRNA expression of CD3ε and CD3ζ in Jurkat cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs IM group;#P＜0.05 vs CD3ζ in the same group.图3 SEA、IM及SEA+IM对Jurkat细胞CD3ε链与CD3ζ链mRNA表达的影响

4 SEA、IM及SEA+IM对Jurkat细胞CD3ε和ζ链蛋白表达的影响

单独SEA组CD3ε链蛋白表达上调(P＜0.05); CD3ζ链变化不大;单独IM组CD3ε和ζ链蛋白表达均下调(P＜0.05)。与单纯IM组相比，SEA+IM组逆转IM下调CD3ε和ζ链蛋白的表达(P＜0.05)，结果类似于mRNA表达水平，见图4。

Figure 4.The effects of SEA，IM and SEA+IM on protein expression of CD3ε and ζ chains measured by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs IM group.图4 Western blotting测定SEA、IM及SEA+IM对Jurkat细胞CD3ε链与CD3ζ链蛋白表达的影响

讨论

IM作为一线药物治疗CML获得巨大成功，明显改善了疾病的生存，但仍存在耐药和复发，除了IM诱导性突变之外，病人免疫功能缺陷，缺乏清除残留病能力，也可能是其中一个协同因素。研究表明，IM及随后开发研制的新型靶向药物(克服耐药问题)，均具有抑制T细胞的免疫应答作用［1］。如何增强特异性T细胞免疫应答，彻底清除白血病干细胞是十分需要重视并加以研究的问题。

TCR/CD3复合体由TCR受体与CD3分子通过盐桥连接而成，CD3分子在TCR信号传递中起关键作用，CD3分子由γ、δ、ε、ζ和η 5条肽链构成，分别形成CD3γε、CD3δε和CD3ζζ二聚体，其胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM)，负责介导T细胞激活信号转导［2-7］。CD3ε和ζ链表达水平下调均可影响T细胞活化水平，与临床肿瘤［8-9］、自身免疫性疾病［10］及慢性感染［11］等疾病发生相关。

目前，已有不少关于超抗原抗肿瘤研究的报道［12-13］，通过超抗原针对性地激活T淋巴细胞靶向杀伤肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤的目的。我们也报道了SEA具有增强抗原诱导特异性T细胞杀伤急性粒细胞白血病和CML的作用［14-16］。据此，我们推测SEA具有拮抗IM导致T细胞抑制的可能性。Jurkat细胞株是一商品化的传代T细胞系，本实验采用SEA与IM共同作用Jurkat细胞，利用实时荧光定量PCR检测CD3ε和ζ链mRNA表达;并采用Western blotting检测这2种蛋白表达。结果表明，单纯SEA组T细胞CD3ε和ζ链mRNA表达水平升高，与之前的研究结果一致［3-4］。单纯IM组T细胞CD3ε和ζ链mRNA表达水平降低，也证实IM通过抑制T细胞活化信号通路中上游信号分子的表达水平，导致T细胞活化受阻［17］。而在联合组中，SEA+IM共同作用于T细胞后，表现出逆转IM下调T细胞CD3ε和ζ链mRNA与蛋白表达水平的作用。本研究结果也显示，各组在mRNA水平上CD3ε链表达受到的影响比CD3ζ链明显，具体原因有待进一步研究。TCR信号通过ITAM的激活转导。TCR复合体中的ITAM分布在CD3ζζ和CD3γε/δε多肽链中。虽然CD3ζ具有3个ITAM，CD3ε链有1个ITAM。但有研究表明:即使在不存在TCRζζ的情况下，CD3γε/δε依然可以激活T细胞［18］，提示CD3γε/δε在T细胞激活过程中也具有重要的激活作用。

综上所述，超抗原 SEA能拮抗 IM对 T细胞CD3ε和ζ链的抑制作用，为逆转IM临床治疗CML导致的免疫抑制提供了依据。为通过激活特异性T细胞进一步清除CML微小残留病变提供新的思路与治疗手段。

［1］Blake SJ，Hughes TP，Lyons AB.Drug-interaction studies evaluating T-cell proliferation reveal distinct activity of dasatinib and imatinib in combination with cyclosporine A［J］.Exp Hematol，2012，40(8):612-621.

［2］陈小华，颜宇辉，王冠明，等.伊马替尼抑制Jurkat T细胞增殖与影响A20和NF-κB表达相关［J］.免疫学杂志，2013，29(10):854-858.

［3］田红霞，高永鹏，林 晨，等.超抗原SEA对K562细胞诱导脐带血单个核细胞上CD3ε链表达的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26(12):1175-1177.

［4］高永鹏，林 晨，田红霞，等.SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用［J］.暨南大学学报:自然科学与医学版，2010，31(2): 154-157.

［5］Sun ZY，Kim ST，Kim IC，et al.Solution structure of the CD3εδ ectodomain and comparison with CD3εγ as a basis for modeling T cell receptor topology and signaling［J］.Proc Natl Acad Sci U S A 2004，101(48):16867-16872.

［6］Wang Y，Becker D，Vass T，et al.A conserved CXXC motif in CD3ε is critical for T cell development and TCR signaling［J］.PLoS Biol，2009，7(12):e1000253.

［7］Kuhné MR，Lin J，Yablonski D，et al.Linker for activation of T cells，zeta-associated protein-70，and Src homology 2 domain-containing leukocyte protein-76 are required for TCR-induced microtubule-organizing center polarization［J］.J Immunol，2003，171(2):860-866.

［8］Glaser R，Andridge R，Yang EV，et al.Tumor site immune markers associated with risk for subsequent basal cell carcinomas［J］.PLoS One，2011，6(9):e25160.

［9］Riccobon A，Gunelli R，Ridolfi R，et al.Immunosuppression in renal cancer:differential expression of signal transduction molecules in tumor-infiltrating，near-tumor tissue，and peripheral blood lymphocytes［J］.Cancer Invest，2004，22(6):871-877.

［10］Hanaoka N，Jabri B，Dai Z，et al.NKG2D initiates caspase-mediated CD3ζ degradation and lymphocyte receptor impairments associated with human cancer and autoimmune disease［J］.J Immunol，2010，185(10):5732-5742.

［11］Deng GM，Beltran J，Chen C，et al.T cell CD3ζ deficiency enables multiorgan tissue inflammation［J］.J Immunol，2013，191(7):3563-3567.

［12］Nielsen SE，Zeuthen J，Lund B，et al.Phase I study of single，escalating doses of a superantigen-antibody fusion protein(PNU-214565)in patients with advanced colorectal or pancreatic carcinoma［J］.J Immunother，2000，23 (1):146-153.

［13］Sundstedt A，Celander M，Hedlund G.Combining tumortargeted superantigens with interferon-alpha results in synergistic anti-tumor effects［J］.Int Immunopharmacol，2008，8(3):442-452.

［14］高永鹏，林 晨，田红霞，等.BCR-ABL-SEA DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):361-366.

［15］徐水凌，毛亚飞，张梅光，等.葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定［J］.中国病理生理杂志，2007，23(1):163-167.

［16］林 晨，高 珂，白 雪，等.超抗原SEA联合PMLRARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响［J］.免疫学杂志，2008，24(5):530-533.

［17］Gao H，Lee BN，Talpaz M，et al.Imatinib mesylate suppresses cytokine synthesis by activated CD4 T cells of patients with chronic myelogenous leukemia［J］.Leukemia，2005，19(11):1905-1911.

［18］Pitcher LA，Mathis MA，Young JA，et al.The CD3 γε/δε signaling module provides normal T cell functions in the absence of the TCR ζ immunoreceptor tyrosine-based activation motifs［J］.Eur J Immunol，2005，35(12):3643-3654.

Superantigen SEA antagonizes inhibitory effect of imatinib on T cell activation

YAN Yu-hui1，CHEN Xiao-hua1，WANG Guan-ming1，LIN Chen1，LI Yang-qiu2
(1Department of Microbiology and Immunology，School of Medicine，2Institute of Hematology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:tlinc@jnu.edu.cn)

AIM:To investigate the effects of staphylococcal enterotoxin A(SEA)on the inhibition of T lymphocyte activation induced by imatinib mesylate(IM).METHODS:Jurkat cells were stimulated with SEA(2 mg/L)and IM(5 nmol/L)for 24 h.The mRNA expression of CD3ε and ζ chains was measured by real-time fluorescence quantitative PCR.The protein levels of CD3ε and ζ chains were detected by Western blotting.RESULTS:The expression of CD3ε and ζ chains at mRNA and protein levels was down-regulated in the Jurkat cells stimulated by IM alone.These down-regulations of CD3ε and ζ chains were reversed by the stimulation of IM combined with SEA.The antagonistic effect of SEA on IM-mediated inhibition of CD3ε mRNA expression was significantly greater than that on CD3ζ mRNA.CONCLUSION:SEA antagonizes imatinib-mediated inhibitory effect on T cell activation.

Superantigen;Staphylococcal enterotoxin A;Imatinib;T-lymphocytes;Antigens，CD3

R364

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.004

1000-4718(2014)03-0404-04

2013-10-21

2014-01-16

国家自然科学基金资助项目(No.81270604);广东省自然科学基金重点项目(No.S2013020012863);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(No.21612116)

△通讯作者Tel:020-85220257;E-mail:tlinc@jnu.edu.cn