X线照射增加大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性*

王 洁， 陆克义， 周军涛， 李险峰△

(山西医科大学第一医院1神经内科，2核医学科，3放疗科，山西太原 030001)

X线照射增加大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性*

王 洁1， 陆克义2， 周军涛3， 李险峰3△

(山西医科大学第一医院1神经内科，2核医学科，3放疗科，山西太原 030001)

目的：观察胸部X线放射治疗大鼠对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性。方法：用胸部单次照射X线20 Gy构建放射性心脏损伤模型，采用完全随机分组方法将Wistar大鼠分为假损伤组、损伤组、假损伤+假手术组、假损伤+缺血/再灌注组、损伤+假手术组和损伤+缺血/再灌注组，于创伤后2周行心肌缺血/再灌注。通过BL-410生物信号记录分析系统记录各组大鼠左心室发展压(LVDP)、左心室压力上升的最大速率(+dp/dtmax)和左心室压力下降的最大速率(-dp/dtmax);采用ELISA方法检测大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB);用BI2000图像分析软件测定心肌梗死面积占总面积的百分比。结果：损伤+缺血/再灌注组离体心功能明显低于假损伤+缺血/再灌注组(P＜0.01)，损伤+缺血/再灌注组血清cTnI和CK-MB水平显著高于假损伤+缺血/再灌注组(P＜0.01)，损伤+缺血/再灌注组心肌梗死面积显著大于假损伤+缺血/再灌注组(P＜0.01)。结论：X线照射增加大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性。

放射性心脏损伤;心肌缺血;再灌注损伤;敏感性

随着三维适形、调强适形及图像引导等精确放射治疗技术的广泛应用，胸部肿瘤患者的生存时间明显延长［1］，而在放射治疗过程中位于纵膈的心脏不可避免地要受到射线影响。已有临床资料显示这部分患者心血管疾病的发病率和死亡率都明显高于对照人群;据统计，由放疗所导致的放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease，RIHD)已成为非肿瘤死亡的首要原因［2］。X线照射可导致继发性心脏损伤，临床表现为冠状动脉疾病、心功能障碍，甚至出现充血性心力衰竭，从而抵消了肿瘤患者由放射治疗产生的部分生存受益［3-4］。因此，在强调通过放射治疗提高肿瘤患者生存率的同时，避免RIHD是提高这些患者疗效和生存质量的重要保证。然而，RIHD是由于X线照射直接损伤所致还是放射治疗后心脏组织对不良刺激(如缺血/再灌注损伤)的敏感性增高所致还不清楚。为此，本文通过研究放射治疗后心肌组织对缺血/再灌注损伤的反应性，拟探讨RIHD的可能机制，从而为临床寻找放射治疗所致RIHD的最佳预防及治疗方案、进而降低死亡率提供直接的实验基础和理论依据。

材料和方法

1 动物、主要试剂和仪器

实验动物的使用遵循《中华人民共和国卫生部令(第55号)-医学实验动物管理实施细则》，以及《山西医科大学实验动物管理细则》，并得到了山西医科大学动物保护协会的批准。健康雄性Wistar大鼠72只，体重200～250 g，清洁级。心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin I，cTnI)测定试剂盒(Burlingame);肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)测定试剂盒(上海玉兰生物技术研究所);硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT;Sigma);直线加速器(Varian IX);计算机生物信号采集分析系统(BL-410);小动物呼吸机(DH-150);注射用甲氧异腈［Cu (MIBI)4BF4］(北京师宏药物研制中心);高锝［99Tcm］酸钠注射液(原子高科股份有限公司); BHP6602小型γ相机(滨松光子股份有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠放射性心脏损伤模型的建立及分组 将大鼠按完全随机分组方法分为 6组:假损伤组(sham)、损伤组(RIHD)、假损伤+假手术组(sham +NIR)、假损伤+缺血/再灌注组(sham+IR)、损伤+假手术组(RIHD+NIR)和损伤+缺血/再灌注组(RIHD+IR)，每组12只，6只用于离体心功能和血清学指标测定，6只用于心肌梗死面积测定。RIHD模型制备:10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定，行螺旋CT定位心脏，采用Varian IX直线加速器局部照射，采用前、后、左、右4个野照射，按生物效应剂量(biological effective dose，BED)公式将临床常规分割照射剂量(80 Gy)换算为单次照射剂量约为20 Gy，单次照射源靶距100 mm。

2.2 心肌缺血/再灌注模型的制备 大鼠在X线照射后2周行心脏缺血/再灌注。Wistar大鼠经1%戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰卧位，于颈部至剑突去毛切开皮肤，钝性分离气管，连接麻醉呼吸机，开胸后进行辅助呼吸，吸气∶呼气比为1∶2。于胸骨左缘第一肋间开胸暴露心脏，轻压挤出心脏，剪开心包膜，在左心耳下方以心脏表面左冠状静脉主干为标志，用6/0号细线结扎左冠状动脉前降支中上部，迅速将心脏放回胸腔。心肌缺血30 min后，松开结扎细线恢复血供，心肌再灌注3 h。术前、缺血后及再灌注后各记录心电图1次，以缺血后ST段抬高作为心肌缺血造模成功的标志。假手术组仅穿线而未结扎冠状动脉。

2.3 Langendorff离体心脏灌流 猛击大鼠后枕部致昏，迅速开胸取出心脏，放入预冷的Krebs-Henseleit液(K-H液)中，修剪后将主动脉悬挂于Langendorff灌流装置上，用充以95%O2与5%CO2混合气体的 K-H液灌流。K-H液的成分为:118 mmol/L NaCl，4.75 mmol/L KCl，1.19 mmol/L KH2PO4，1.19 mmol/L MgSO4·7H2O，2.54 mmol/L CaCl2·2H2O，25 mmol/L NaHCO3，0.5 mmol/L EDTA，11 mmol/L glucose(pH 7.4，37℃)。将起搏电极置于离体心脏右室，刺激强度设置为2倍阈强度，频率为200 beats/min。将一乳胶水囊(直径约3～5 mm)经左心房插入左心室内，水囊内充有一定量的灌流液，水囊导管另一端与压力换能器相连，稳定15～20 min后采用BL-410生物信号记录分析系统记录大鼠左室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)、左室压力升高最大速率(+dp/dtmax)及左室压力下降最大速率(-dp/dtmax)。

2.4 ［99Tcm］-MIBI制备与心肌显像 取甲氧异腈冻干品1瓶，在无菌操作条件下，依高锝［99Tcm］酸钠注射液的放射性浓度，取2～6 mL(370～3 700 MBq)注入瓶内，充分振摇，使冻干品溶解后立于沸水浴中直立加热 10～15 min，取出冷却至室温，得到［99Tcm］-MIBI。取［99Tcm］-MIBI 18.5 MBq，经大鼠尾静脉缓慢推注，30 min后采集前位平面显像，采集仪器为BHP6602小型γ相机，探头配置低能高分辨针孔准直器，能峰为140 keV，窗宽20%，矩阵256× 256×16，计数预置500K。应用感兴趣区(regions of interest，ROI)技术勾画心脏及上纵隔区域，得到其平均计数，应用心脏/纵隔比值半定量分析心脏的［99Tcm］-MIBI摄取值。

2.5 血清学指标检测 各组大鼠于造模后3 h，麻醉状态下从腹主动脉取血3 mL，将血液常温静置30 min后3 000 r/min离心10 min，取上清液放入-20℃冰箱待测。参照试剂盒说明操作，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定cTnI和CK-MB。

2.6 心肌梗死面积测定 采用硝基四氮唑蓝染色法测定心肌梗死面积。缺血/再灌注后3 h，于麻醉下迅速取心脏，放入生理盐水中冲洗，仔细去除左心室外其它部分(两侧心房、大静脉及右心室)，-80℃冻存。取出-80℃冻存的心脏，垂直于左心室长轴方向，自心底向心尖将其切成厚度均匀的6片，放入1%的三羟甲基氨基甲烷溶液(pH 7.4)中，37℃水浴5～10 min。正常左室心肌染为暗蓝色，梗死区心肌则不染色。用BI2000图像分析软件测定心肌梗死面积占总面积的百分比，即梗死面积百分比=心肌梗死面积之和/心肌总面积之和×100%。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计学软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 RIHD后2周大鼠心肌［99Tcm］-MIBI摄取的变化

RIHD后2周损伤组心肌［99Tcm］-MIBI摄取明显减低(1.96±0.13 vs 1.68±0.19，P＜0.05)，这提示RIHD后2周大鼠心肌血流灌注及线粒体功能降低，见图1。

Figure 1.Changes of［99Tcm］-MIBI uptake in the myocardium 2 weeks after RIHD.H:heart;M:upper mediastinum.A:sham;B:RIHD.图1 RIHD后2周心肌［99Tcm］-MIBI摄取的变化

2 缺血/再灌注后大鼠离体心功能的变化

LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指标在sham组、RIHD组、sham+NIR组及RIHD+NIR组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。这提示X射线损伤和(或)假手术不影响LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax的变化。sham+IR组LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax明显低于sham+NIR组(P＜0.01);RIHD+IR组LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显低于sham+IR组(P＜0.01)，见表1。这提示RIHD后2周行缺血/再灌注大鼠LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低更明显。

表1 各组大鼠心功能参数的比较Table 1.The parameters of cardiac functions in the rats with different treatments(Mean±SD.n=6)

3 缺血/再灌注后大鼠血清cTnI和CK-MB水平变化

RIHD+NIR组cTnI和CK-MB水平高于sham+ NIR组(P＜0.05);sham+IR组cTnI和CK-MB水平明显高于sham+NIR组(P＜0.01);RIHD+IR组cTnI和CK-MB水平明显高于sham+NIR组(P＜0.01)，见表2。这提示RIHD后2周行缺血/再灌注术大鼠cTnI和CK-MB水平升高更显著。

表2 各组血清cTnI和CK-MB的比较Table 2.The concentrations of cTnI and CK-MB in the rats with different treatments(μg/L.Mean±SD.n=6)

4 缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面积的影响

硝基四氮唑蓝染色正常心肌为暗蓝色，梗死区心肌为红色。Sham+NIR组与RIHD组心肌梗死面积比较无显著差异(P＞0.05);sham+IR组和RIHD +IR组明显高于sham+NIR组(P＜0.01);RIHD+ IR组心肌梗死面积明显高于 sham+IR组(P＜0.01)，见图2。这提示RIHD后2周行缺血/再灌注术心肌梗死面积明显增大。

讨论

Figure 2.The infarct volume of the myocardium in the rats with different treatments(NBT staining).A:sham+NIR; B:RIHD;C:sham+IR;D:RIHD+IR.Mean± SD.n=6.##P＜0.01 vs sham+NIR group;＊＊P＜0.01 vs sham+IR group.图2 各组心肌梗死的NBT染色

胸部肿瘤发病率逐年上升，严重威胁人类的健康。放射治疗在胸部肿瘤的治疗中占有重要地位，而X线照射所导致的心血管疾病的发病率和死亡率都明显高于对照人群［5］。因此，在强调通过放射治疗提高肿瘤患者生存率的同时，避免RIHD是提高这些患者疗效和生存质量的重要保证。胸部X射线照射首先损伤心脏的微循环系统，导致血管内皮功能和结构损伤，形成粥样斑块，继而发生血管内腔狭窄或闭塞，出现微循环障碍而发生心肌缺血、缺氧，进而累及心肌细胞，引起心肌细胞死亡，并最终导致心功能损伤［5］，在临床上可表现为冠心病、急性心衰等。

本实验参照Kuse等［6］提出的RIHD模型制备方法，给予实验大鼠心脏单次局部照射剂量20 Gy，采用［99Tcm］-MIBI心肌显像来评价心肌的血流量和线粒体功能。［99Tcm］-MIBI是临床上早期诊断冠心病、心肌缺血的常用检查方法［7-8］，当线粒体膜电位正常时，［99Tcm］-MIBI可通过被动扩散进入线粒体膜，而当线粒体膜电位下降时，心肌对［99Tcm］-MIBI摄取障碍。由于在整体情况下，机体会通过神经体液调节维持重要器官功能的稳定性，为排除神经体液的影响，我们检测了创伤后大鼠的离体心功能，其能客观反映损伤后心脏早期的实际变化，常用LVDP及±dp/dtmax等指标来衡量左室收缩功能，其中+dp/ dtmax反映心肌纤维收缩性能的改变;-dp/dtmax是反映心肌舒张性能的指标。结果发现2周后大鼠心脏出现线粒体功能损伤，而心脏离体心功能的未出现异常。

RIHD常处于亚临床状态，经过相当长的潜伏期才出现临床症状，多在放射治疗后数月至数年，常表现为心包渗出、冠状动脉疾病、心瓣膜功能不全、传导异常和充血性心衰等［9］。本实验发现，与假损伤组比较，损伤后2周大鼠的心肌线粒体功能已发生改变，而离体心功能并无明显改变，而线粒体功能受损后是否会引起心脏对损伤的敏感性增加尚不清楚。因此，我们选取大鼠RIHD后2周作为缺血/再灌注处理的时点，采用经典的结扎冠状动脉建立缺血/再灌注模型，观察心肌损伤的情况。目前，临床上将cTnI特异性和CK-MB敏感性结合起来作为判断心肌细胞损伤的重要指标［10］。组织解剖学上心肌梗死面积是观察心肌损伤的直接指标。本实验对RIHD模型大鼠进行缺血/再灌注处理，结果发现损伤+缺血/再灌注组大鼠与假损伤+缺血/再灌注组、损伤+假手术组比较，离体心功能明显下降，血清cTnI和CK-MB显著升高，心肌梗死面积明显增大。这些结果提示，X线照射损伤增加了大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性。然而具体机制还不清楚，有待于进一步研究。

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X-ray irradiation increases sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion injury in rats

WANG Jie1，LU Ke-yi2，ZHOU Jun-tao3，LI Xian-feng3
(1Department of Neurology，2Department of Nuclear Medicine，3Department of Radiotherapy，First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.E-mail:lixianfeng-lxf@263.net)

AIM:To observe the sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion(I/R)injury in the rats with chest radiotherapy.METHODS:The radiation-induced heart disease model was established by local 20 Gy of X-ray irradiation in the chest.Male Wistar rats(n=42)were randomly divided into 6 groups:sham trauma group，trauma group，sham trauma+sham operation group，sham trauma+I/R group，trauma+sham operation group and trauma+I/R group.The rats were subjected to 30 min of ischemia and 1 h of reperfusion 2 week after trauma.The left ventricular developed pressure(LVDP)and±dp/dtmaxwere recorded by BL-410 biological signal recording and analysis system.The serum cardiac troponin I(cTnI)and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were measured by ELISA.The myocardial infarct size was determined by nitroblue tetrazolium(NBT)staining method and BI2000 image analysis software.RESULTS:Compared with sham trauma+I/R group，significant decreases in LVDP and±dp/dtmaxwere observed in trauma+I/R group(P＜0.01)with significant increases in the infarct size and the concentrations of cTnI and CK-MB(P＜0.01).CONCLUSION:Chest X-ray irradiation increases the sensitivity of myocardium to I/R injury in rats.

Radiation-induced heart disease;Myocardial ischemia;Reperfusion injury;Sensitivity

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.007

1000-4718(2014)03-0419-04

2013-10-14

2014-01-16

国家自然科学基金资助项目(No.81371600);山西医科大学科技创新基金资助项目(No.057279);山西医科大学博士启动基金资助项目(No.055217)

△通讯作者Tel:0351-4639351;E-mail:lixianfeng-lxf@263.net