穿心莲内酯对口腔癌生长的影响*

亓翠玲， 周鑫磊， 叶 杰， 杨 扬， 章倩倩， 李江超， 兰 天， 何晓东， 王丽京

(广东药学院血管生物学研究所，广东广州 510006)

穿心莲内酯对口腔癌生长的影响*

亓翠玲， 周鑫磊， 叶 杰， 杨 扬， 章倩倩， 李江超， 兰 天， 何晓东， 王丽京△

(广东药学院血管生物学研究所，广东广州 510006)

目的：探讨穿心莲内酯对口腔癌的作用及其机制。方法：用穿心莲内酯及其对照药物治疗金黄地鼠颊囊癌，通过测量肿瘤体积观察治疗效果。用免疫组化检测穿心莲内酯对肿瘤血管和肿瘤细胞增殖的作用，用TUNEL法检测穿心莲内酯对肿瘤细胞凋亡的作用，用免疫组化检测凋亡信号分子caspase-3的表达情况。结果：穿心莲内酯治疗组颊囊癌的肿瘤体积明显比对照组小，肿瘤微血管密度和增殖的肿瘤细胞也明显低于对照组，肿瘤细胞的凋亡率明显高于对照组，而且治疗组中caspase-3明显被活化。结论：穿心莲内酯通过抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖以及促进肿瘤细胞凋亡，抑制了金黄地鼠颊囊癌的生长。穿心莲内酯通过caspase-3途径诱导了肿瘤细胞的凋亡。

穿心莲内酯;细胞凋亡;血管生成;口腔肿瘤

穿心莲是爵床科穿心莲属植物，是一种天然的抗炎植物药。穿心莲内酯(andrographolide，Andro)是其主要有效成分之一，是一种二环双萜内酯类化合物。Andro是一种传统的抗炎药物，而且研究报道Andro还对动脉粥样硬化及高血压有一定疗效以及具有免疫调节等作用［1-2］。许多研究报道 Andro对肿瘤具有明显的抑制作用。体外研究表明Andro对MCF-7乳腺癌细胞及HCT-116直肠癌细胞有显著的抑制作用［3］，Andro还可以提高肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的表达及细胞周期蛋白标志物的表达，使得淋巴细胞抗肿瘤细胞的细胞毒活性增加，这可能起到间接的抗肿瘤作用。Andro可以通过阻滞细胞周期影响肿瘤的发生发展。研究报道Andro使MCF-7细胞滞留在G0/G1期，主要是通过半合成一个 Andro的类似物 DRF3188，DRF3188使细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶和细胞周期蛋白D1等细胞周期因子表达量明显减少［4］。Andro还可诱导HL-60细胞周期阻滞［5］，Andro可以通过激活caspase-3及caspase-8诱导前列腺癌PC3细胞凋亡［6］。研究报道Andro还具有抗血管生成的作用。通过主动脉环实验发现Andro可以阻抑微血管的生长。Andro治疗黑色素瘤后，发现肿瘤的微血管数与对照组相比有显著差异［1］。本研究用二甲基苯并蒽［7，12-dimethylbenz(a)anthracene，DMBA］诱导金黄地鼠颊囊癌模型，发现Andro可以抑制地鼠颊囊癌的增殖，诱导颊囊癌细胞凋亡，抑制肿瘤诱发的新生血管的生成，从而发挥抑制颊囊癌生长的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 叙利亚金黄地鼠80只，6～8周龄，体重80～100 g，雌雄各半，购于中山大学实验动物中心。

1.1 试剂 DMBA购自 Sigma。工作液浓度: 0.5%;配制量:100 mL。配制方法:DMBA粉末5 mg溶解于100 mL丙酮中，-20℃保存。BrdU粉末及rabbit anti-mouse BrdU抗体购自北京中杉金桥有限公司。Rabbit anti-mouse vWF(von Willebrand factor)抗体购自Santa Cruz，rabbit anti-mouse caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology。TUNEL试剂盒购自Roche。

2 方法

2.1 金黄地鼠颊囊癌模型的构建 每周一、三、五下午以4号水彩笔在地鼠单侧颊囊(右侧)涂致癌剂DMBA，沿同一方向刷3次，涂抹剂量相当于0.1 mL，至9周时停止涂药。至第14周时用Andro治疗地鼠颊囊癌模型。测量每只动物的肿瘤体积(计算公式:0.52×长径×短径2)，将肿瘤体积过大和过小的动物剔除后，还剩余52只肿瘤模型动物，然后将实验动物用单纯随机数字法分组，随机分为3组，分组情况为Andro治疗组22只，对照组分别为4H-Andro(Andro经过化学结构修饰后药物活性消失的化合物)组16只和Blank组14只。图1为金黄地鼠颊囊癌模型的建立。

Figure 1. Chemical-induced hamsterbuccalpouch cancer model.A:hamster;B:the fixing device of hamster;C:hamster buccal pouch;D:chemical-induced hamster buccal pouch cancer.图1 金黄地鼠颊囊癌模型的建立

2.2 治疗方案 各组动物均以腹腔注射方式给药，治疗剂量为6.2 μg/g体重，每周治疗2次，共治疗5周，每次治疗前都要观察肿瘤体积、体重并做记录。

2.3 免疫组化 将金黄地鼠肿瘤组织用甲醛固定后，石蜡包埋，切片。切片脱蜡后，用PBS洗3次，每次5 min。高压修复10 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。10%BSA封闭后，加rabbit anti-mouse vWF抗体、rabbit anti-mouse BrdU抗体或rabbit anti-mouse caspase-3抗体，4℃过夜。第2天，复温后，PBS洗，滴加anti-rabbitⅡ抗，37℃ 50 min。DAB显色，苏木精复染后，脱水、透明、封片。

2.4 TUNEL 组织切片脱蜡至水，沸热修复7 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。加TUNEL反应液，37℃孵育90 min。PBS洗后，加Converter-POD，37℃孵育30 min。DAB显色后苏木素复染，脱水，封片。

3 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件包和SigmaPlot软件处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Andro抑制了金黄地鼠颊囊癌肿瘤体积的增长

Andro治疗组与实验对照组相比，治疗组金黄地鼠颊囊癌肿瘤体积的增长速度明显减慢，而对照组肿瘤体积增长速度快，瘤体易破，易出血，说明Andro可以抑制肿瘤的生长，见图2。

2 Andro对肿瘤细胞增殖的影响

BrdU抗体免疫染色阳性结果为增殖程度高的肿瘤细胞核区棕黄色着色。BrdU表达结果表明实验组和对照组有显著差异(P＜0.01)，见图3。

3 Andro对肿瘤组织中微血管密度(microvascular density，MVD)的影响

Andro治疗组内MVD比对照组明显降低，见图4，说明Andro抑制了肿瘤组织内新生血管的形成。

4 Andro对肿瘤组织中细胞凋亡的影响

4.1 Andro促进了肿瘤组织中细胞凋亡 Andro治疗组内凋亡细胞明显比空白对照组和4H-Andro组多，见图5，说明Andro促进肿瘤组织内细胞的凋亡。

4.2 Andro通过活化caspase-3而诱导肿瘤组织内细胞凋亡 Andro可显著诱导caspase-3活化，从而促进凋亡的发生，见图6。

Figure 2.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer growth.Mean±SD.n=22 in Andro group;n=16 in 4H-Andro group;n=14 in blank group.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Andro.图2 Andro抑制了金黄地鼠颊囊癌肿瘤体积的增长

Figure 3.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer cell proliferation.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank or 4H-Andro.图3 Andro抑制了肿瘤细胞增殖

Figure 4.MVD in hamster buccal pouch cancer tissues was investigated by vWF immunohistochemicalstaining.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.图4 Andro抑制肿瘤组织内新生血管的形成

Figure 5.Tumor cell apoptosis in hamster buccal pouch cancer tissues was detected by TUNEL.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.图5 Andro促进肿瘤组织内细胞凋亡

讨论

口腔癌是人体常见的肿瘤之一［7］。近年来口腔癌的发病率有明显的上升趋势，特别是发病年龄趋向年轻化。口腔鳞癌不仅发病率高，且恶性程度较高;往往造成语音、咀嚼、吞咽、面容等功能障碍和严重的面容毁损，并威胁到患者的生命;五年生存率只有60%左右。尽管近来口腔癌手术方法的不断改进以及放疗、化疗的广泛应用，但口腔癌的五年生存率并没有明显提高［8］。

地鼠颊囊癌是Salley［9］在1954年建立的一种化学诱导的自发性肿瘤模型，是目前公认的研究口腔癌的良好动物模型。地鼠口腔特有的颊囊结构是较为理想的诱癌部位，利用化学致癌剂二甲基苯并蒽诱发颊囊口腔癌，它与人体自然成癌过程极为相似，能够动态、直观地观察肿瘤形成中单纯增生、异常增生、原位癌、浸润癌各阶段的病理变化和检测成癌过程中相关分子标志物的动态改变［10-11］，因此它广泛地应用于口腔鳞状细胞癌病理学、细胞动力学、癌变潜力、抗癌药物筛选和肿瘤早期预防的研究中［12-13］。

Figure 6.The activation of caspase-3 in hamster buccal pouch cancer tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.图6 Andro活化了caspase-3

近年来，文献报道Andro对多种肿瘤细胞有杀伤作用［3］，但Andro对化学致癌剂诱导的口腔肿瘤形成有何种作用目前国内还未见报道。为回答上述第一个问题，即穿心莲内酯是否对肿瘤的生长有抑制作用，我们首先构建了金黄地鼠颊囊模型，在诱癌成功后用Andro进行治疗，通过观察肿瘤体积来考察Andro对口腔癌生长的抑制作用。结果显示An dro治疗组肿瘤体积的增长较blank组及4H-Andro组明显减缓，经统计学分析组间有显著差异，说明Andro可以抑制口腔癌生长。为进一步研究Andro对口腔癌的作用机制，我们取地鼠肿瘤组织，用免疫组织化学的方法探讨Andro作用后地鼠颊囊癌组织中其增殖、凋亡及血管等生物学特性变化的情况。

肿瘤的发生发展与诸多因素相关，如细胞增殖的增强、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，而具有高增殖活性是肿瘤细胞的生物学特性之一。因此我们检测了地鼠颊囊癌组织中细胞的增殖活性。BrdU是一种可以与胸腺嘧啶竞争性参与细胞S期合成的药物，又因为其带有溴标记物，因此可以检测细胞的增殖情况［14-15］。通过BrdU实验我们发现，用Andro治疗实验动物后，其肿瘤组织内细胞的增殖活性受到明显抑制。肿瘤的增殖与凋亡存在平衡关系。肿瘤的发展通常是增殖加强与凋亡受阻共同作用的结果。我们通过TUNEL实验发现Andro可以显著促进颊囊癌肿瘤组织中细胞凋亡。同时Andro可以显著诱导地鼠颊囊组织caspase-3活化水平增加。Zhou等［5］在体外实验研究中证实，Andro可以通过Bcl-2家族蛋白诱导caspase-3及caspase-9活化从而促进肿瘤细胞的凋亡，这与我们的研究结果相一致。还发现 Andro作用于地鼠颊囊癌后，肿瘤组织内的MVD水平显著降低，说明Andro可以抑制肿瘤诱发的新生血管生成。同时有文献报道，在C57BL/6鼠中，腹腔注射Andro可显著抑制接种B16F10黑色素瘤细胞诱导的新生血管形成，治疗组微血管数与对照组相比有显著差异［1］。

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Effect of andrographolide on oral squamous cell carcinogenesis

QI Cui-ling，ZHOU Xin-lei，YE Jie，YANG Yang，ZHANG Qian-qian，LI Jiang-chao，LAN Tian，HE Xiao-dong，WANG Li-jing
(Vascular Biology Institute，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China.E-mail:wanglijing62@ 163.com)

AIM:To study the effect of andrographolide(Andro)on oral squamous cell carcinogenesis.METHODS:Chemical-induced hamster buccal pouch cancer model was used.The tumor cell proliferation，apoptosis and microvessel density(MVD)were detected by immunohistochemical staining.RESULTS:Compared with control group，the tumor volume，MVD and tumor cell proliferation in Andro group were significantly decreased.The cell apoptotic cell number in Andro group was higher than that in control group.Caspase-3 was also activated in Andro group.CONCLUSION:Andro inhibits tumor growth by suppressing proliferation，decreasing MVD and promoting apoptosis in the hamster buccal pouch.Furthermore，Andro promotes tumor cell apoptosis through caspase-3 pathway.

Andrographolide;Apoptosis;Angiogenesis;Mouth neoplasms

R739.8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.003

1000-4718(2014)03-0400-04

2013-09-23

2013-12-23

国家自然科学基金资助项目(No.31271455)

△通讯作者Tel:020-39352126;E-mail:wanglijing62@163.com