利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠脂联素及胰岛素抵抗的影响*

曾志刚， 徐丽姝， 关丽嫦， 高慧亭

(广东省医学科学院，广东省人民医院消化科，广东省老年医学研究所，广东广州 510080)

利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠脂联素及胰岛素抵抗的影响*

曾志刚， 徐丽姝△， 关丽嫦， 高慧亭

(广东省医学科学院，广东省人民医院消化科，广东省老年医学研究所，广东广州 510080)

目的：观察利拉鲁肽(Lira)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血清和肝组织脂联素(ADP)及胰岛素抵抗的影响。方法：雄性SD大鼠30只，随机分为3组，分别予普通饮食(ND组)10只、高脂饮食(HFD组)10只和高脂饮食加利拉鲁肽腹腔注射(Lira组)10只。高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型，建模成功后Lira组予利拉鲁肽腹腔注射治疗4周。16周末处死各组大鼠，生物化学法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)，分光光度计测定游离脂肪酸(FFAs)，酶联免疫吸附法测定胰岛素和ADP。结果：与HFD组比较，Lira组大鼠体质量、肝指数、胰岛素抵抗指数、血清TG、TC、ALT、FBG及肝匀浆TG、TC、FFAs显著下降(均P＜0.05)，血清及肝组织ADP明显升高(P＜0.05)，肝脏脂肪变性程度明显减少至恢复正常(P＜0.05)，肝组织ADP含量与肝脏FFAs含量呈负相关。结论：利拉鲁肽改善胰岛素抵抗和肝脏脂肪变的可能机制之一与其升高血清及肝组织脂联素水平有关。

利拉鲁肽;胰高血糖素样肽1;非酒精性脂肪性肝病;脂联素;胰岛素抵抗

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种常见的慢性肝病，在世界范围内广泛分布。目前认为NAFLD是与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤［1］。NAFLD的发生、发展涉及到遗传、环境和生活方式等多种因素，与肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、糖尿病等有关，被认为是代谢综合征的肝脏表现［2-4］。脂联素(adiponectin，ADP)是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，有研究认为ADP具有改善糖脂代谢及抗炎等作用，在NAFLD的发生发展中起着重要作用［5］。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)类似物利拉鲁肽(liraglutide，Lira)具有降低体重及改善脂质代谢紊乱等作用，已经越来越多地被应用于NAFLD的治疗研究中［6-7］。Lira的上述作用是否与ADP的影响有关，目前报道较少，本研究通过高脂饮食(high-fat diet，HFD)建立NAFLD大鼠模型，探讨Lira对NAFLD大鼠胰岛素抵抗、血清和肝组织ADP含量及肝脏脂质和游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)含量的影响，并探讨ADP与血清甘油三酯(triglyceride，TG)及肝脏FFAs的关系。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠30只，体重(140± 10)g，购自中山医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 GLP-1类似物Lira购自丹麦诺和诺德公司;血清胰岛素和ADP试剂盒为国产ELISA试剂盒;FFAs、甘油三酯及胆固醇试剂盒均购自南京建成生物技术研究所。

2 方法

2.1 动物模型的建立 6周龄雄性SD大鼠30只，普通饲料喂养1周后随机抽取10只为正常饮食(normal diet，ND)组，继续普通饲料喂养，余20只为制模组给予高脂饲料(其中普通饲料88%、猪油10%、胆固醇2%)至第14周末，随机处死正常饲养组1只和制模组1只，经检测制模组肝指数、血脂、肝转氨酶等显著增高，进行肝组织切片HE染色肝细胞明显脂肪变性确认制备模型成功。制模组剩余19只随机分为2组:HFD组9只，继续以高脂饲料喂养;Lira组10只继续予高脂饮食同时Lira 0.6 mg· kg-1·d-1腹腔注射。18周末予水合氯醛溶液腹腔麻醉处死所有大鼠，下腔静脉采血分离血清，取部分肝组织于液氮速冻后低温保存，另取部分肝组织行病理检查。

2.2 肝指数 实验结束时称体重和肝湿质量，肝湿重/体重×100%即为计算肝指数。

2.3 血清中指标的测定 将下腔静脉留取的血液3 000 r/min离心10 min，取上层血清，通过全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、空腹血糖(fas-ting blood glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和TG，空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)和ADP采用酶联免疫吸附法测定，计算胰岛素抵抗指数(homeostasis assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。

2.4 肝匀浆指标的测定 精确称取相同部位的肝组织200 mg，置于1.8 mL匀浆介质，冰浴条件下2 000 r/min匀浆3 min，制备成10%的肝组织匀浆。肝组织ADP通过酶联免疫吸附法测定，肝组织TG和TC使用生物化学法检测，分光光度计测定肝匀浆FFAs。

2.5 病理学检查 部分肝组织以40%中性甲醛溶液固定，制备石蜡切片，采用HE染色;同时取部分冰冻肝组织制备冰冻切片，采用油红O染色。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析。采用Pearson相关系数分析测量指标的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 大鼠一般情况、体质量及肝指数的变化

与ND组比较，HFD组大鼠性情温顺，不喜动，毛色黄腻，Lira组与ND组相似。HFD组与ND组相比，体重和肝指数均显著增高(P＜0.05);与HFD组相比，Lira组体重和肝指数均显著下降(P＜0.05); Lira组与ND组相比，体重无显著差异(P＞0.05)，肝指数增高(P＜0.05)，见表1。

表1 大鼠体重、肝指数及血清各项指标的检测结果Table 1.Results of body weight，liver index，and serum indicators in rats(Mean±SD)

2 血清及肝匀浆生物化学指标的检测

HFD组与ND组相比，大鼠血清TG、TC、ALT、FBS及肝匀浆TG、TC、FFAs均明显升高(P＜0.05)，血清和肝组织ADP明显降低(P＜0.05)，差别均有统计学意义。Lira组与HFD组相比，血清TG、TC、ALT、FBS及肝匀浆TG、TC、FFAs均明显降低(P＜0.05)，血清和肝组织ADP明显升高(P＜0.05)，差别均有统计学意义。Lira组与ND组相比，各项指标均无显著差异(P＞0.05)，见表1、2。

3 胰岛素抵抗指数

HFD组的HOMA-IR＞2.69，ND组和Lira组的HOMA-IR＜2.69，根据2010年美国糖尿病协会糖尿病指南的标准:HOMA-IR＞2.69为有胰岛素抵抗的标准，ND组和Lira组未产生胰岛素抵抗，胰岛素敏感性提高，与HFD组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 大鼠HOMA-IR及肝匀浆各项指标的检测结果Table 2.Results of liver homogenate indicators in rats(Mean±SD)

4 病理学检查结果

光镜下显示，ND组肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀。HFD组大鼠肝细胞肿胀，体积较正常明显增大，出现脂肪变性，胞质内可见大小不等的脂滴空泡，以大泡性脂肪滴为主，汇管区有以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，部分出现点状坏死和灶状坏死，已进展为非酒精性脂肪肝炎阶段。Lira组肝细胞明显较高脂组肝细胞体积缩小，未见脂肪变性，肝小叶内未见炎症，见图1、2。

5 Lira对血清及肝组织脂联素的影响

HFD组与ND组相比，大鼠血清及肝匀浆ADP明显降低(P＜0.05)。Lira干预后，血清及肝组织ADP明显升高(P＜0.05)，见图3。

6 血清ADP与血清TG及肝组织ADP与肝组织FFAs的关联性

血清 ADP与血清 TG具有负相关性(r= -0.54，P＜0.05);肝组织ADP含量与肝组织FFAs含量具有负相关性(r=-0.45，P＜0.05)。

Figure 1.Histopathological observation of rat liver tissues(HE staining，×400).A:ND group;B:HFD group;C:Lira group.图1 HE染色观察各组大鼠肝组织病理学变化

Figure 2.Histopathological observation of rat liver tissues(Oil red O staining，×400).A:ND group;B:HFD group;C:Lira group.图2 油红O染色观察各组大鼠肝组织病理学变化

Figure 3.The effect of liraglutide(Lira)on adiponectin(ADP).A:the level of ADP in serum;B:the level of ADP in liver homogenates.*P＜0.05 vs ND group;△P＜0.05 vs HFD group.图3 Lira对脂联素的影响

讨论

NAFLD是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合征。NAFLD的发病机制至今尚未完全阐明。较为成熟的是“二次打击”学说。第一次打击是引起NAFLD的首发原因，包括各种原因导致的脂质代谢紊乱，使过多的脂质在肝细胞内沉积，而以胰岛素抵抗和氧应激脂质过氧化为核心的二次打击导致脂肪变的肝脏发生炎症坏死和纤维化［1］。

GLP-1是一种葡萄糖依赖性肠促胰素，可通过增加脂肪酸氧化，改善肝脏的脂肪病变及氧应激，对非酒精性脂肪肝起到明显的改善作用［8］。GLP-1可改善肝脏脂肪变性，并不单纯依赖于减轻体重所致整体代谢参数的改善［9］。GLP-1可能通过增加肝脏载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)的表达或上调ADP水平，显著降低TG、TC水平，减少低密度脂蛋白的合成［10］。Lira是 GLP-1类似物，与天然 GLP-1有97%的同源性，具备GLP-1全部生理作用［11］。本研究模型组大鼠肝组织FFAs、血清TG及TC显著升高，ADP与FFAs和TG呈明显负相关，提示ADP降低导致TG和FFAs升高可能是NAFLD形成的机制之一。经Lira治疗后能使NAFLD大鼠脂质代谢紊乱明显改善。

NAFLD已被证实与胰岛素抵抗的发生发展密切相关［12-13］。胰岛素抵抗引起NAFLD的主要原因是脂代谢紊乱和高胰岛素血症，导致FFAs增多，增多的FFAs又可通过抑制胰岛素的信号转导而加重IR［14-15］。同时大量的FFAs在线粒体内被氧化，产生过多的活性氧簇(reactive oxide species，ROS)，当肝细胞内ROS的产生及其作用超过抗氧化系统清除能力时便产生氧化应激［16］。Lira可改善β细胞功能，降低体质量和低血糖发生率［11，17］。但有关其对胰岛素敏感性及其机制的研究较少。本研究高脂组FFAs、FBG和HOMA-IR明显上升，肝组织ADP含量与肝组织 FFAs含量呈显著负相关。Lira干预后FFAs、FBG和HOMA-IR均显著改善并恢复至正常饲养组水平，说明NAFLD大鼠经Lira处理后，糖脂代谢明显改善，有效逆转了IR。

ADP是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，大量的动物和人体实验发现ADP与肥胖、IR、冠心病及NAFLD 密切相关［18-19］。LI等［20］测量了 60例NAFLD患者及60例正常患者的血清ADP含量和HOMA-IR，说明低ADP与IR呈负相关，是引起IR的独立影响因素。本研究显示模型组大鼠血清及肝组织ADP明显低于对照组，HOMA-IR明显上升，说明低ADP可能在NAFLD的发生中起一定的作用，模型组大鼠经Lira处理后，血清及肝组织ADP明显增高，HOMA-IR明显上升，提示Lira改善IR可能与升高血清及肝组织ADP有关。

本研究在前期发现GLP-1类似物Lira具有抗炎、改善氧应激及脂质过氧化、减轻体重及抑制摄食等作用的基础上，进一步从体内代谢角度对其在NAFLD的机制上进行研究。结果表明Lira处理4周后，大鼠血浆及肝组织ADP水平升高的同时，糖脂代谢明显改善，IR明显降低，因此，我们推测Lira改善NAFLD胰岛素抵抗和肝脏脂肪变的可能机制之一与其升高血清及肝组织ADP水平有关。

［1］Tessari P，Coracina A，Cosma A，et al.Hepatic lipid metabolism and non-alcoholic fatty liver disease［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2009，19(4):291-302.

［2］Tarantino G，Finelli C.What about non-alcoholic fatty liver disease as a new criterion to define metabolic syndrome?［J］.World J Gastroenterol，2013，19(22): 3375-3384.

［3］林妙霞，李泽楷，罗敏琪，等.非酒精性脂肪性肝病与代谢综合征的关系研究［J］.中国病理生理杂志，2010，26(12):2465-2466.

［4］李 新，袁 莉，李 进，等.长期高脂喂养大鼠胰岛功能改变与胰岛炎症反应有关［J］.中国病理生理杂志，2009，25(5):949-954.

［5］Mendez-Sanchez N，Chavez-Tapia NC，Villa AR，et al.Adiponectin as a protective factor in hepatic steatosis［J］.World J Gastroenterol，2005，11(12):1737-1741.

［6］Nauck M，Frid A，Hermansen K，et al.Long-term efficacy and safety comparison of liraglutide，glimepiride and placebo，all in combination with metformin in type 2 diabetes:2-year results from the LEAD-2 study［J］.Diabetes Obes Metab，2013，15(3):204-212.

［7］Mells JE，Fu PP，Sharma S，et al.Glp-1 analog，liraglutide，ameliorates hepatic steatosis and cardiac hypertrophy in C57BL/6J mice fed a Western diet［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，302(2):G225-G235.

［8］Svegliati-Baroni G，Saccomanno S，Rychlicki C，et al.Glucagon-like peptide-1 receptor activation stimulates hepatic lipid oxidation and restores hepatic signalling alteration induced by a high-fat diet in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Liver Int，2011，31(9):1285-1297.

［9］Samson SL，Bajaj M.Potential of incretin-based therapies for non-alcoholic fatty liver disease［J］.J Diabetes Complications，2013，27(4):401-406.

［10］李龙辉，李 伶，杨刚毅，等.利拉鲁肽对低脂联素血症小鼠胆固醇代谢相关基因的影响［J］.中华内分泌代谢杂志，2011，27(7):599-603.

［11］Wajcberg E，Amarah A.Liraglutide in the management of type 2 diabetes［J］.Drug Des Devel Ther，2010，4:279-290.

［12］ Polyzos SA，Kountouras J，Zavos C.Nonalcoholic fatty liver disease:the pathogenetic roles of insulin resistance and adipocytokines［J］.Curr Mol Med，2009，9(3): 299-314.

［13］李兰芳，郭 玉，唐国涛，等.高脂饮食导致大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用机制研究［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):310-314.

［14］周 鑫，韩德五，李素红，等.非酒精性脂肪性肝病在代谢综合征相关的2型糖尿病发病中的作用［J］.中国病理生理杂志，2011，27(7):1352-1359.

［15］陈晓路.非酒精性脂肪肝发病机制研究进展［J］.人民军医，2010，53(2):147-148.

［16］Bjornsson E，Angulo P.Non-alcoholic fatty liver disease［J］.Scand J Gastroenterol，2007，42(9):1023-1030.

［17］杨文英.人GLP-1类似物利拉鲁肽的最新研究进展［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26(9):841-844.

［18］Polyzos SA，Toulis KA，Goulis DG，et al.Serum total adiponectin in nonalcoholic fatty liver disease:a systematic review and meta-analysis［J］.Metabolism，2011，60(3): 313-326.

［19］Sheng T，Yang K.Adiponectin and its association with insulin resistance and type 2 diabetes［J］.J Genet Genomics，2008，35(6):321-326.

［20］Li YL，Yang M，Meng XD，et al.The relationship of leptin and adiponectin with insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18(6):459-462.

Effects of liraglutide on adiponectin and insulin resistance in rats with non-alcoholic fatty liver disease

ZENG Zhi-gang，XU Li-shu，GUAN Li-chang，GAO Hui-ting
(Department of Gastroenterology，Guangdong Institute of Geriatrics，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China.E-mail:xulishu70@163.com)

AIM:To investigate the effects of glucagon-like peptide 1 analog，liraglutide，on adiponectin and insulin resistance in the rats with diet-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).METHODS:Male rats were randomly divided into 3 groups:normal diet(ND)group(n=10)，high-fat diet(HFD)group(n=10)，and HFD with intraperitoneal injection of liraglutide group(n=10，first 12 weeks with HFD，later 4 weeks with liraglutide).All treatments continued for 16 weeks，and then the rats were killed ethically and the blood samples and liver tissues were collected.The levels of alanine aminotransferase(ALT)，fasting blood glucose(FBG)，total cholesterol(TC)and triglyceride (TG)were detected by a biochemical automatic analyzer.The levels of free fatty acids(FFAs)，fasting insulin(FINS) and adiponectin were measured by RIA and ELISA.RESULTS:Compared with HFD group，the body weight，liver index，homeostasis assessment-insulin resistance(HOMA-IR)，the serum levels of TG，TC，ALT and FBG，and the liver levels of TG，TC and FFAs in the rats in liraglutide group were apparently lower，the degree of hepatic steatosis and inflammatory activity significantly decreased(P＜0.05)，and the level of adiponectin in the serum and liver homogenate increased obviously(P＜0.05).The level of adiponectin in the liver homogenate was negatively correlated with the levels of FFAs in the liver homogenate.CONCLUSION:Liraglutide is beneficial for NAFLD rats to improve insulin resistance and reduce hepatic steatosis by increasing the level of adiponectin in the serum and liver tissues.

Liraglutide;Glucagon-like peptide 1;Non-alcoholic fatty liver disease;Adiponectin;Insulin resistance

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.026

1000-4718(2014)03-0533-05

2013-10-08

2013-12-30

广东省自然科学基金资助项目(No.10151008008000003;No.S2012010010953)

△通讯作者Tel:020-83827812;E-mail:xulishu70@163.com