SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IKKγ/NF-κB信号的影响*

黄 炜， 徐 玲， 周雪琴， 徐 勇△

(1泸州医学院附属医院内分泌科，四川泸州 646000;2成都市新都区人民医院内分泌科，四川成都 610500)

SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IKKγ/NF-κB信号的影响*

黄 炜1，2， 徐 玲1， 周雪琴1， 徐 勇1△

(1泸州医学院附属医院内分泌科，四川泸州 646000;2成都市新都区人民医院内分泌科，四川成都 610500)

目的：探讨小泛素相关修饰物(SUMO)化修饰对高糖诱导的肾系膜细胞IκB激酶γ(IKKγ)/NF-κB信号的影响。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞，设正常对照组、高糖干预组和渗透压对照组:用免疫印迹和RT-PCR法检测各组细胞SUMO1、SUMO2/3、IKKγ和NF-κB p65的表达;用免疫共沉淀检测SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用。结果：高糖呈浓度和时间依赖性上调系膜细胞SUMO和NF-κB p65表达(均P＜0.01)。各组细胞IKKγ的蛋白与mRNA表达差异无统计学意义(均P＜0.05);高糖组SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用减弱(均P＜0.01)。结论：高糖影响IKKγ的SUMO化修饰，可能参与了高糖诱导的肾系膜细胞NF-κB信号激活的调控。

小泛素相关修饰物;IκB激酶γ;NF-κB;糖尿病肾病

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病特有而严重的微血管并发症，近年来的研究表明炎症是糖尿病肾病发生发展的中心环节，核因子κB (NF-κB)是目前公认的介导炎症信号的主要信号通路并且在DN发病过程中扮演着重要的角色。IκB激酶(IκB kinase，IKK)γ又名NEMO(NF-κB essential modulator)，分子量为48 kD，是IKK复合物的调节亚基，介导了NF-κB信号经典途径的激活。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)修饰是与泛素化修饰类似的蛋白质翻译后修饰，参与了NF-κB、TGF-β等信号通路的调控。SUMO化修饰是否通过影响NF-κB信号参与DN的发病尚未见文献报道。为此，本研究观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾系膜细胞SUMO(SUMO1、SUMO2/3)与IKKγ的表达，并探讨在高糖诱导下肾系膜细胞SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用，为进一步研究高糖条件下SUMO化修饰对NF-κB信号调控的分子机制打下基础。

材料和方法

1 主要材料

大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1，购于中国典型培养物保藏中心);兔抗大鼠 SUMO1单克隆抗体(Abcam);兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗体(Millipore);免抗大鼠IKKγ多克隆抗体(Santa Cruz);兔抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体(CST);小鼠抗大鼠GAPDH抗体(碧云天生物)

2 方法

2.1 细胞培养和实验分组 HBZY-1细胞常规培养于含10%小牛血清的低糖DMEM中，培养条件为37℃、5%CO2。对数生长期细胞用于实验，随机分设(1)正常对照组(NC组):使用低糖(含葡萄糖5.6 mmol/L)培养基;(2)高糖干预组(HG1、HG2和HG3组):培养基含葡萄糖浓度分别为10、20和30 mmol/ L;(3)渗透压对照组(OP组):培养基含5.6 mmol/L葡萄糖和24.4 mmol/L甘露醇。各组分别作用6 h、12 h和24 h后收获细胞。

2.2 免疫印迹(Western blotting)法 取细胞加蛋白抽提液，加样品电泳，转膜，封闭，分别加兔抗大鼠IKKγ多克隆抗体(1∶800)、兔抗大鼠SUMO1单克隆抗体(1∶800)、兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗体(1∶600)、兔抗大鼠 NF-κB p65 单克隆抗体(1∶1 000)和小鼠抗大鼠 GAPDH单克隆抗体(1∶2 000)，4℃过夜，PBST洗膜后分别用HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgGⅡ抗孵育1 h，化学发光显影。以IKKγ、SUMO、NF-κB p65与GAPDH蛋白条带平均吸光度值之比表示蛋白含量。

2.3 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) 将细胞随机分为:正常对照组(NC)、20 mmol/L高糖组(HG2)、渗透压对照组(OP)和正常IgG阴性对照组(IgG)，分别在含上述不同干预因素的培养基中培养24 h。加入含蛋白酶体抑制剂的IP裂解液，定量加入兔抗大鼠IKKγ多克隆抗体、正常大鼠IgG抗体(IgG组)，4℃轮转摇晃充分孵育。将蛋白-抗体复合物移入离心柱并加入含protein A/G琼脂糖，密封轮转孵育1 h;离心洗脱琼脂糖，将免疫沉淀产物煮沸变性后行 Western blotting分析，用兔抗大鼠SUMO1单克隆抗体(1∶800)和兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗体(1∶600)孵育检测SUMO蛋白与IKKγ蛋白间相互作用。

2.4 RT-PCR 总RNA提取试剂盒提取各组肾系膜细胞总RNA，反转录成cDNA于PCR反应管中扩增，SUMO1上游引物5’-TATGGACAGGACAGCAG-3’，下游引物5’-CCATTCCCAGTTCTTTTG-3’，扩增产物为170 bp。SUMO2/3上游引物5’-GACGAGAAACCCAAGGA-3’，下游引物5’-CTGCCGTTCACAATAGG-3’，扩增产物为140 bp;内参照GAPDH上游引物5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，扩增产物为114 bp。IKKγ上游引物5’-CAGCCTATCACCACCTCTT-3’，下游引物5’-GCACTTGGGACAACAGA-3’，扩增30个循环后，上样2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统成像，以IKKγ、SUMO1和SUMO2/3的灰度值除以GAPDH的灰度值分别得到各检测指标的相对灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，各组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 高糖上调系膜细胞SUMO表达

与NC组比较，高糖作用6 h、12 h和24 h后，各组系膜细胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表达均增强(均P＜0.05)，见图1A;其中30 mmol/L葡萄糖作用24 h后系膜细胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表达增强达峰值。不同浓度高糖干预系膜细胞24 h后，与NC组比较，SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表达量随糖浓度增加，差异有统计学意义(均P＜0.05)，见图1B;SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表达量与OP组比较，差异有统计学意义(均P＜0.05)。以上结果提示高糖呈时间和浓度依赖性上调系膜细胞SUMO蛋白与mRNA表达。

2 高糖对系膜细胞IKKγ表达无明显影响

与NC组比较，30 mmol/L葡萄糖作用6 h、12 h和24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表达差异无统计学意义，作用时间延长至48 h和72 h后差异仍无统计学意义(均P＞0.05)，见图2A;各组间差异亦无统计学意义(均P＞0.05)。与NC组比较，不同浓度高糖作用24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表达差异无统计学意义(均P＞0.05)，见图2B。以上结果提示高糖刺激对系膜细胞IKKγ表达无明显影响。

Figure 1.The expression of SUMO1 and SUMO2/3 at protein and mRNA levels in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HG2 or HG3 group.图1 Western boltting和RT-PCR检测不同浓度和不同时间高糖作用系膜细胞后SUMO1、SUMO2/3蛋白及mRNA的表达

3 高糖减弱系膜细胞IKKγ的SUMO化修饰

免疫共沉淀结果显示，用抗IKKγ抗体免疫沉淀IKKγ-未知蛋白复合物后，免疫印迹法电泳、转膜、抗SUMO1和SUMO2/3抗体孵育，化学发光示在约80 kD处出现明显的SUMO1-IKKγ(图3A)和SUMO2/ 3-IKKγ(图3B)结合条带，在17 kD(SUMO1和SUMO2/3)处出现明显的游离SUMO条带;同时，正常IgG对照组在相应蛋白分子位置未显现蛋白条带，提示免疫共沉淀结果可靠。进一步比较NC组、HG2组、OP组及IgG对照组蛋白分子表达量，与NC组比较，HG2组与OP组蛋白分子表达明显减少，差异有统计学意义(均P＜0.05);HG2组与OP组间比较差异无统计学意义(均P＞0.05)，见图3C、D。以上结果提示高糖可能诱导SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用减弱。

4 高糖激活NF-κB信号

与NC组比较，高糖干预24 h后，随糖浓度提高，NF-κB p65蛋白表达逐步增加，差异有统计学意义(均P＜0.05)，见图4，提示高糖呈浓度依赖性增强肾系膜细胞NF-κB p65蛋白表达。

Figure 2.The protein and mRNA expression of IKKγ in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.图2 Western boltting和RT-PCR检测不同浓度和不同时间高糖作用系膜细胞后IKKγ蛋白及mRNA的表达

Figure 3.SUMOylation of IKKγ in rat mesangial cells after high-glucose challenge detected by co-immunoprecipitation.A:SUMO1 interacted with IKKγ;B:SUMO2/3 interacted with IKKγ;C:interaction between SUMO1 and IKKγ in different groups;D: interaction between SUMO2/3 and IKKγ in different groups.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.图3 免疫共沉淀检测高糖作用系膜细胞后对IKKγ SUMO化修饰的影响

Figure 4.The expression of NF-κB p65 protein in rat mesangial cells after high-glucose challenge at different glucose concentrations detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.图4 Western blotting检测不同浓度高糖作用系膜细胞后NF-κB p65蛋白的表达

讨论

与泛素化介导的蛋白降解不同，SUMO化修饰是通过蛋白-蛋白相互作用而赋予靶蛋白新的生物特性，在加强蛋白质的稳定性、核质转运、信号转导、转录调控等过程中都发挥了广泛而重要的作用［1］。本研究发现，正常糖浓度组大鼠系膜细胞SUMO表达被抑制在很低的水平，伴随着糖浓度的提高，SUMO表达逐渐增强。本研究结果与大鼠低氧性肺动脉高压形成过程中SUMO表达增强的结果类似［2］，于是推测SUMO蛋白可能作为一种细胞应激蛋白，参与多种细胞信号转导蛋白的翻译后修饰，从多种层面动态地影响细胞信号转导及相关靶基因的转录和翻译，可能参与包括糖尿病肾病在内的多种疾病的病理生理改变。

IKK是一个多亚基催化酶，是NF-κB信号与上游刺激因子(LPS、胰岛素等)的联系枢纽，包括催化亚基IKKα、IKKβ以及调节亚基IKKγ。活化的IKK使IκBα蛋白2个丝氨酸残基(S32、S36)磷酸化，继而发生泛素化降解，NF-κB活化转位入核，启动炎症相关基因(如IL-6)的转录和翻译［3］。

虽然IKK复合物的催化作用依赖于2个催化亚基，但是近年的研究表明［4］，调节亚基IKKγ结构的完整性对IKK复合物的活性及下游NF-κB的激活起到重要作用，如单独过表达IKKγ二聚体和IKK相互作用基序都能激活IKK，但是在全长的IKKγ缺失时这2种过表达状态对IKK的激活都比较弱;并且，IKKγ涉及的蛋白间相互作用可能影响多种信号通路功能的发挥。本研究表明，高糖刺激对肾系膜细胞IKKγ mRNA与蛋白表达无明显影响，推测IKKγ表达有相对稳定性，其本身不参与催化NF-κB信号的活化。

作为调节亚基，IKKγ在NF-κB途径中被视为一种支架蛋白，可能与多种分子相互作用，如在TNF刺激下，IKKγ对接头蛋白RIP1的募集对于IKK和NF-κB活性起到重要作用。最近的研究显示，IKKγ可被SUMO修饰，修饰位点在K277和K309这2个赖氨酸残基上，参与了DNA损伤诱导的NF-κB信号活化［5］。另有研究发现，SUMO化酶PIASy可诱导并促进SUMO与IKKγ共价结合，活化IKK复合物，使NF-κB信号放大，抗氧化剂能逆转DNA损伤诱导的IKKγ SUMO化修饰［6］。到目前为止只发现了IKKγ特异性的SUMO1修饰，而SUMO2/3能否修饰IKKγ迄今未见报道。本研究证明，正常条件下SUMO1和SUMO2/3均可修饰IKKγ，高糖刺激减弱SUMO1和SUMO2/3与IKKγ的相互作用(即SUMO化)，推测这可能是高糖影响IKK下游信号转导途径，激活NF-κB信号，参与糖尿病肾病发病的又一可能机制。

综上所述，本研究结果表明SUMO化修饰可能参与了高糖诱导的肾系膜细胞IKKγ/NF-κB信号的激活，其作用机制可能与高糖减弱SUMO与IKKγ的相互作用、改变IKK复合物的信号转导途径及上调NF-κB p65表达有关。

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Effects of SUMOylation on IKKγ/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells treated with high glucose

HUANG Wei1，2，XU Ling1，ZHOU Xue-qin1，XU Yong1
(1Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China;2Department of Endocrinology，People’s Hospital of Xindu District，Chengdu 610500，China.E-mail:xywyll@aliyun.com)

AIM:To investigate the effects of SUMOylation on IκB kinase γ(IKKγ)/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells(GMCs)treated with high glucose.METHODS:Cultured HBZY-1 rat GMCs were divided into normal glucose group and high glucose groups，and mannitol was used for osmotic control.The expression of SUMO1，SUMO2/3，IKKγ and NF-κB p65 was measured by Western blotting and RT-PCR.Interaction between SUMO and IKKγ was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS:Compared with normal glucose group，the expression of SUMO and NF-κB p65 was increased in high glucose groups in a dose-and time-dependent manner.The expression of IKKγ was not changed by high glucose.The SUMOylation of IKKγ in high glucose groups was significantly decreased as compared with normal glucose group.CONCLUSION:High glucose obviously changes the interaction between SUMO and IKKγ in cultured rat mesangial cells，which may be involved in the activation of NF-κB by taking a special influence on the SUMOylation of IKKγ/NF-κB signaling molecules.

Small ubiquitin-related modifier;I-kappa B kinase gamma;NF-kappa B;Diabetic nephropathies

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.027

1000-4718(2014)03-0538-05

2013-10-25

2013-01-15

四川省教育厅科研项目(No.11ZB223)

△通讯作者Tel:0830-3161546;E-mail:xywyll@aliyun.com