大剂量苯巴比妥对惊厥幼鼠浦肯野细胞电生理功能的影响*

谭晓丽， 师长宏， 任颖鸽， 杜永平， 张月萍△

(第四军医大学1西京医院儿科脑发育研究室，2实验动物中心，3西京医院全军中医内科中心，陕西西安 710032)

大剂量苯巴比妥对惊厥幼鼠浦肯野细胞电生理功能的影响*

谭晓丽1▲， 师长宏2▲， 任颖鸽1， 杜永平3△， 张月萍1△

(第四军医大学1西京医院儿科脑发育研究室，2实验动物中心，3西京医院全军中医内科中心，陕西西安 710032)

目的：研究单次大剂量苯巴比妥对惊厥幼鼠小脑浦肯野细胞(Purkinje cells，PCs)电生理功能的影响。方法：将健康新生7 d(P7)SD幼鼠随机分为正常对照组、惊厥模型组和苯巴比妥组。给予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg制作惊厥模型。苯巴比妥按120 mg/kg一次性腹腔注射。采用全细胞膜片钳记录法在小脑脑片上记录小脑PCs动作电位及PCs兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current，EPSC)的长时程抑制(long-term depression，LTD)。结果：(1)苯巴比妥组幼鼠小脑PCs诱发动作电位的阈值降低，频率增高。(2)苯巴比妥组幼鼠小脑PCs EPSC幅值在低频刺激后15 min内降低的幅度显著大于其它2组。结论：单次大剂量苯巴比妥增加了惊厥幼鼠小脑PCs的兴奋性，并改变了小脑PCs的突触功能。

苯巴比妥;惊厥发作;长时程抑制;浦肯野细胞

惊厥(convulsion)是新生儿时期常见的神经系统症状，其发生率为1.5‰～18‰［1］。苯巴比妥作为抗惊厥的一线药物被广泛应用于临床。近年来，苯巴比妥可能对未成熟脑造成的不良影响备受关注［2］。临床及动物实验均已证实，母孕期使用苯巴比妥可导致胎儿小头、生长发育迟滞、神经管缺损、唇腭裂和指趾畸形等宫内发育异常［3］。生后早期多次使用苯巴比妥(phenobarbital，PB)可显著抑制未成熟脑的海马区神经元新生细胞的增殖和存活［4］，甚至单次给予较大剂量苯巴比妥也会导致幼鼠的脑重量显著减轻［5］。因此，治疗新生儿惊厥时常规使用的苯巴比妥负荷量(20 mg/kg)对新生儿脑功能是否有不良影响亟待研究。本研究以临床治疗新生儿惊厥常用的负荷剂量为基础，换算获得苯巴比妥在新生幼鼠的用药剂量［6］。在新生SD幼鼠的脑片上，观察单次大剂量苯巴比妥对惊厥后幼鼠小脑主神经元浦肯野细胞(Purkinje cells，PCs)电生理特征和平行纤维(parallelfiber，PF)-PC突触传递的影响。目的是阐明单次大剂量苯巴比妥对惊厥后幼鼠神经元兴奋性和突触功能的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 试剂 NaCl、KCl、NaH2PO4·H2O、MgSO4· 7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖、葡萄糖酸钾、HEPES、EGTA、磷酸肌酸二钠、Na2ATP、Na3GTP、KOH和戊四氮均购自Sigma;PB由第四军医大学第一附属医院西京医院提供。

1.2 溶液 人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126.0，KCl 5.0，NaH2PO4·H2O 1.25，MgSO4·7H2O 2.0，CaCl2· 2H2O 2.0，NaHCO326.0，葡萄糖10.0，pH 7.35～7.45，渗透压310～320 omOsm/L。电极内液成分(mmoL/L):葡萄糖酸钾 120.0，KCl 5.0，HEPES 10.0，EGTA 5.0，CaCl2·2H2O 0.5，MgSO4·7 H2O 2.0，磷酸肌酸二钠2.0，Na2ATP 4.0，Na3GTP 0.3，用0.5 mol/L KOH调pH为7.35～7.45，渗透压285～300 omOsm/L。

1.3 仪器 振动切片机(VT1000S，Leica)，正置显微镜(Zeiss)，微电极操纵仪(Model 285)，放大器(Axon 700A)，模拟-数字转换器(Digidata1322A)，电极拉制仪(P-97)，刺激器(PG4000A)，渗透压测定仪(Model 210)，恒流泵(HL-2，上海泸西仪器厂)。

2 方法

2.1 惊厥动物模型的制备及PB剂量的确认 健康新生7 d(P7)SD幼鼠由第四军医大学动物实验中心提供。给予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg，标准依据Racine分级标准［7］分为5级。选择V级视为惊厥全面发作作为惊厥模型。PB治疗新生儿惊厥的临床负荷剂量是20 mg/kg，依据人与大鼠体表面积换算公式［6］确定幼鼠PB相当于临床负荷量的剂量为120mg/kg，一次性腹腔注射给药。

2.2 动物分组 正常对照组:SD幼鼠不制造惊厥模型，一次性腹腔注射与 PB等容积的生理盐水(normal saline，NS);惊厥模型组(seizure):SD幼鼠惊厥全面发作后，一次性腹腔注射与PB等容积的生理盐水;PB组:SD幼鼠惊厥全面发作后，一次性腹腔注射120 mg/kg PB。每组动物均为10只，各组幼鼠腹腔注射后30 min处死取小脑。

2.3 脑片制备 取各组SD幼鼠小脑，放入充95% O2+5%CO2混合气的0℃ ACSF中，约1 min后取出，修整后移入切片槽内固定，用振动切片机切出300 μm厚脑片，立即转移至32℃ ACSF中孵育约30 min，移至室温下继续孵育1 min后开始记录。整个过程通以95%O2+5%CO2混合气体。

2.4 全细胞膜片钳记录 将脑片移至记录浴槽内，先在低倍镜下确定小脑皮层的细胞层，再在高倍镜下选择表面光滑、轮廓清晰、立体感强的浦肯野细胞进行全细胞膜片钳记录。玻璃微电极充灌内液后电阻为7～9 MΩ，钳制电压为-70 mV。记录过程中使用恒流泵持续向记录浴槽内灌注含95%O2+5% CO2混合气体的ACSF，流速为2 mL/min。在保持膜电位为-70 mV的电流钳状态下，通过向细胞内注射去极化电流(50～800 pA，100 ms)诱发记录细胞的动作电位。用充有ACSF的玻璃微电极刺激小脑脑片的分子层，诱发并记录小脑浦肯野细胞的兴奋性突触 后 电 流 (excitatory postsynaptic current，EPSC)。长时程抑制(long-term depression，LTD)则以一串频率为1Hz的300个脉冲组成的低频刺激(low-frequency stimulation，LFS)诱发，LFS刺激后的EPSC记录时间为30 min以上，记录期间膜钳制电压为-70 mV。

3 统计学处理

数据采集使用pCLAMP软件，数据测量使用Clampfit软件。数据应用Origin 8.0分析，以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因数方差分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 单次大剂量苯巴比妥对幼鼠小脑PCs兴奋性的影响

在正常对照组脑片上，细胞内注射去极化电流诱发PCs动作电位的阈值为(172.90±13.21)mV。惊厥模型组的阈值为(165.20±10.64)mV，与正常对照组相比无显著差异(P＞0.05)，见图1B。苯巴比妥组的阈值为(113.60±13.64)mV，与正常对照组相比有显著差异(P＜0.01)，见图1B;与惊厥对照组相比也有显著差异(P＜0.01)，见图1B。同时，惊厥模型组诱发PCs动作电位的频率较正常对照组升高(P＜0.05)，见图1C。苯巴比妥组诱发PCs动作电位的频率较正常对照组有显著差异(P＜0.01)，见图1C;与惊厥模型组相比也有显著差异(P＜0.01)，见图1C。这表明苯巴比妥组幼鼠小脑PCs兴奋性较其它2组明显升高。

Figure 1.Effect of phenobarbital on the excitability of the PCs in neonatal rats with seizures.A:the typical firing of PCs evoked by 400 pA current injection.The membrane potential was hold at-70 mV.B:the threshold of action potential of PCs.C: different current intensity-evoked firing rate of PCs.Mean±SD.n=11.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs seizure;#P＜0.05;##P＜0.01 vs control.图1 苯巴比妥对惊厥幼鼠小脑PCs兴奋性的影响

2 单次大剂量苯巴比妥对幼鼠小脑PF-PC突触可塑性的影响

低频刺激小脑PF，可使PCs EPSC呈现LTD。各组给予低频刺激后EPSC幅值均明显降低。正常对照组PCs的EPSC幅值在低频刺激后15 min内逐渐降低到基线的(78.03±12.55)%，低频刺激后持续稳定于该水平。惊厥模型组EPSC幅值在低频刺激后15 min内降低到基线的(74.69±11.58)%，然后持续稳定于该水平。惊厥模型组EPSC幅值的下降幅度与正常对照组相比无显著差异(P＞0.05)，见图2B;苯巴比妥组的幅值在低频刺激后15 min内迅速降低到基线的(62.69±10.56)%，低频刺激后15～30 min，EPSC幅值恢复到基线水平的(72.69± 9.58)%并稳定维持。苯巴比妥组EPSC幅值降低的程度在低频刺激后的15 min内显著大于正常对照组和惊厥模型组，均有显著差异(P＜0.01)，见图2B。而在低频刺激后15～30 min，3组的幅值变化无显著差异(P＞0.05)，见图2C。这表明苯巴比妥改变了小脑PC的突触活动。

讨论

本研究发现单次大剂量使用苯巴比妥对惊厥幼鼠小脑PCs的影响有2个方面，一是导致PCs兴奋性增高，二是改变了小脑PCs的突触活动。

早先的临床研究表明，苯巴比妥即使在常规用量和规范用药的情况下仍可出现不良反应，加重惊厥的发作是其不良反应之一。黄铁栓等［8］回顾总结了自1998年10月～2003年7月诊治的服抗癫痫药物后发作加重的45例儿童癫痫患者，其中因服用苯巴比妥加重发作者6例。蒋莉等［9］临床研究也发现苯巴比妥在血药浓度正常时可引起肌阵挛、肌强直发作增加。本研究结果显示惊厥幼鼠使用苯巴比妥后PCs兴奋性反比正常对照组和惊厥模型组增高，这可能是临床上苯巴比妥加重惊厥的机制之一。苯巴比妥使惊厥幼鼠PCs兴奋性增高的机制可能与未成熟脑γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)驱动的抑制系统不健全有关，即当GABA受体激活使Cl-通道开放时，由于未成熟脑神经细胞内Cl-浓度高于细胞外，导致Cl-外流，引起膜去极化，从而使神经元兴奋性增高。此外，大剂量苯巴比妥可能抑制了小脑环路的抑制性中间神经元，使PCs脱抑制，从而导致阈值减低和放电频率增加。

Figure 2.Effect of phenobarbital on EPSC LTD of the PCs in neonatal rats with seizures.A(left):pooled data for EPSC LTD of the PCs induced by low-frequency stimulation(LFS);A(right):the examples of average EPSC before and after LFS.Each waveform is the average of six traces(every 10 s).Black，red and blue represents EPSC before LFS，first 15 min after LFS and 15～30 min after LFS，respectively.B:normalized EPSC amplitude during the first 15 min after LFS(data from a shown in A);C:normalized EPSC amplitude during 15～30 min after LFS(data from b shown in A).Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs seizure.图2 苯巴比妥对惊厥幼鼠小脑PCs EPSC LTD的影响

LTD是中枢神经系统突触可塑性的一种重要模式［10］。小脑LTD在运动性学习记忆中起重要作用［11］。行为学研究发现围产期暴露于苯巴比妥的鼠在八臂迷宫试验、水迷宫试验等空间学习实验中显示能力下降［12］。但是，苯巴比妥是否影响幼鼠小脑LTD的诱导尚未见报道。本研究结果发现单次给予大剂量苯巴比妥使PCs的EPSC在低频刺激后早期下降的幅度显著大于正常对照组和惊厥模型组，表明苯巴比妥改变了小脑LTD的表达模式。这一结果表明，即使是单次给予大剂量苯巴比妥也会改变小脑PCs的突触功能，可能对幼鼠的学习和认知功能产生不良影响。

谷氨酸作为一种主要的兴奋性神经递质，通过受体介导的兴奋性机制在惊厥的发生过程中具有重要作用［13］。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)是2种谷氨酸递质门控受体亚型，每种亚型都是一种递质门控离子通道，二者介导了脑内大多数快速兴奋性突触传递过程［14］。LTD的诱导与NMDA和AMPA的活动密切相关［15］。单次大剂量苯巴比妥引起的小脑LTD表达模式的改变提示其可能对NMDA和AMPA受体活动产生了影响。

综上所述，单次大剂量苯巴比妥使惊厥幼鼠PCs兴奋性增高，小脑LTD表达模式异常，可能是苯巴比妥加重惊厥和导致学习记忆障碍等不良反应的重要机制。本研究结果提示，临床使用负荷量苯巴比妥治疗新生儿惊厥时一定要严格掌握适应症，以减少苯巴比妥对新生儿脑发育可能造成的不良影响。

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Effect of high-dose phenobarbital on electrophysiological characteristics of Purkinje cells in neonatal rats with seizures

TAN Xiao-li1，SHI Chang-hong2，REN Ying-ge1，DU Yong-ping3，ZHANG Yue-ping1
(1Laboratory of Brain Development，Pediatric Department，Xijing Hospital，2Laboratory Animal Center，3Department of Traditional Chinese Medicine，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China.E-mail: ypzhang@fmmu.edu.cn;ddyypp@fmmu.edu.cn)

AIM:To investigate the effect of single high-dose phenobarbital(PB)on the electrophysiological characteristics of cerebellar Purkinje cells(PCs)in neonatal rats with seizures.METHODS:Seven-day-old Sprague-Dawley neonatal rats were randomly divided into control group，seizure group and PB group.Seizures were induced by pentetrazole(60 mg/kg，ip)，and PB(120 mg/kg，ip)was applied to neonatal rats in PB group.The evoked action potential and excitatory postsynaptic current(EPSC)long-term depression(LTD)of the PCs were recorded by the technique of whole-cell patch clamp on the cerebellar slices.RESULTS:PB decreased the threshold of action potential in the PCs and increased the fire rate.During the first 15 min after stimulation，LTD was induced，and the inhibition of EPSC of the PCs was enhanced significantly by PB.CONCLUSION:Single high-dose PB increases the excitability of PCs and changes the synaptic functions of cerebellar PCs in the neonatal rats with seizures.

Phenobarbital;Convulsive seizures;Long-term depression;Purkinje cells

R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.025

1000-4718(2014)03-0529-05

2013-11-06

2014-01-14

国家自然科学基金资助项目(No.30871029);第四军医大学西京医院助推计划(No.XJZT10T07)

△通讯作者张月萍Tel:029-84773367;E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;杜永平Tel:029-84771307;E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn

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