双波长HPLC测定非发酵豆制品中人工合成色素

曾玉梅，陈繁华，刘志辉

(梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514071)

目前，我们经常食用的黄色系列的人工合成色素有柠檬黄及其铝色淀、日落黄及其铝色淀等。人工合成色素主要是从煤焦油中制取或以苯、甲苯、萘等芳香烃化合物为原料合成的有机色素［1］，种类多，色泽鲜艳，成本低廉，着色力强，因而被广泛使用。不仅本身有毒，而且还夹杂着重金属等剧毒物质，故对人体健康尤其是儿童健康有不同程度的损害［2］。研究发现，包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分［3］。现标准［4］“食品中合成着色剂的测定”只是包括了饮料、果酒、着色糖果类成分简单的试样处理，直接用聚酰胺吸附色素法测定，并不适合高蛋白非发酵豆制品。

本文参考相关文献［5-6］，采用石油醚去脂，用硫酸和钨酸钠溶液除去蛋白质，聚酰胺粉吸附色素，洗涤后解吸、纯化等处理样品，用双波长HPLC测定非发酵豆制品的人工合成色素，对是否非法添加进行评价。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

日落黄标准溶液 0.500 mg/mL(GBW(E)100003a 12003)、柠檬黄标准溶液 0.500 mg/mL(GBW(E)100001a 12002)均由中国计量科学研究院提供;甲醇，色谱纯;其余试剂均为分析纯;样品为我市7县1区抽查:腐竹14批，豆腐10批。

岛津LC-20A高效液相色谱仪，检测器:日本岛津SPD-20A;LC-20AT泵;Labsolution色谱工作站;AUW220D岛津电子分析天平;HN1006超声波清洁器。

1.2 样品前处理

1.2.1 去脂和提取 取至少200 g样品，用组织绞碎机绞碎。称取绞碎的样品5.0～10.0 g，置于小烧杯中，加入石油醚(30～60℃)50 mL，用玻棒搅拌，放置片刻，弃去石油醚。如此重复3次，除去脂肪，吹干。加入无水乙醇+氨水+水(7+2+1)提取着色剂，通过G3砂芯漏斗抽滤提取液，反复多次，至提取液无色为止。收集全部提取液于100 mL蒸发皿中。

1.2.2 沉淀蛋白质 在70℃水浴上浓缩提取液至10 mL以下。依次加入1.0 mL硫酸溶液(1+9)和1.0 mL 100 g/L钨酸钠溶液，混匀，继续70℃水浴加热5 min，沉淀蛋白质。取下蒸发皿，全部转移至离心管中，离心10 min，上清液倒至100 mL烧杯中，取10 mL水清洗蒸发皿，转移至上述离心管中，振摇30 s，离心10 min后，上清液合并入100 mL烧杯中。

1.2.3 纯化 将上述合并清液加热至70℃。将1.0～1.5 g聚酰胺粉(100～200目)加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，使色素完全被吸附。将吸附色素的聚酰胺粉全部转移到砂芯漏斗中，抽滤，用70℃的200 g/L柠檬酸溶液搅拌洗涤3～5次，然后用甲醇+甲酸(3+2)搅拌洗涤3～5次，至洗出液无色为止，再用水洗至流出液呈中性;用无水乙醇+氨水+水(7+2+1)解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液，蒸发至近干，加水溶解并定容至10 mL，经0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。

1.3 空白溶液

不加样品，同法操作制备。

1.4 标准品溶液的制备

分别精密吸取着色剂标准物质柠檬黄(0.500 mg/mL)0.8 mL、日落黄 (0.500 mg/mL)1.4 mL置100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱为Thermo ODS-2 HYPERSIL(150 mm×4.6 mm×5 μm)，柱 温 30 ℃，流 动 相 甲 醇 (A)-0.02 mol/L 乙酸铵溶液(B)，梯度洗脱(0 ～7 min，87%B→70%B;7～12 min，70%B→50%B;12～16 min，50%B→25%B;16 ～18 min，25%B→0%B;18 ～22 min，0%B→0%B;22 ～25 min，0%B→87%B;25 ～30 min，87%B→87%B);流速为1.0 mL/min，检测波长485，427 nm，进样量为20 μL。

1.6 测定

精密量取标准品溶液、供试品溶液和空白溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算供试品中各着色剂的含量(必要时需扣除空白修正)。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

精密量取标准品溶液 1，2，5，10，20，40 μL 注入液相色谱仪，按色谱条件测定，各平行进样2次。以两次峰面积平均值为纵坐标、各色素的进样量为横坐标作图，进行线性回归，得线性方程柠檬黄为Y=3 079.0X － 1 980.4(r=0.999 8)，日落黄为 Y=2 537.1X －1 507.1(r=1.000 0)，表明柠檬黄在进样量4～160 ng范围内，日落黄在进样量7～280 ng范围内呈良好的线性关系。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC spectrum

2.2 仪器精密度实验

精密吸取标准品溶液20 μL，按色谱条件测定，重复进样5次，结果柠檬黄峰面积RSD为0.21%，日落黄峰面积RSD为0.13%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验

取标准品溶液，在24 h内分别进样20 μL进行测定，记录色谱图。结果表明，不同时间内色谱峰面积基本一致，柠檬黄与日落黄峰面积的 RSD＜0.5%，表明标准品溶液在24 h稳定。

2.4 回收率实验

取6份空白豆制品，精密加入10 mL标准品溶液，按样品前处理制样进行测定，计算回收率，见表1。

表1 柠檬黄与日落黄回收率Table 1 The recovery rate of lemon yellow and sunset yellow

由表1可知，柠檬黄为100.9%(n=6)，日落黄为100.4%(n=6)。

2.5 检出限

取标准品溶液，用逐级稀释法测定检测限，按S/N=3 计，检出浓度日落黄1.4 ng，柠檬黄0.8 ng。

2.6 讨论

2.6.1 样品前处理 非发酵豆制品都富含高蛋白，而油炸豆腐，特制腐竹中含有脂肪油类，王鑫等［7］直接用无水乙醇-氨水-水(70∶20∶10)提取，未去脂去蛋白，进入液相后较多杂质干扰，蛋白质进入液相后遇有机溶剂易变性，造成色谱柱堵塞，报废率高。用石油醚去脂，用硫酸和钨酸钠溶液除去蛋白质，聚酰胺粉吸附色素，洗涤后解吸，纯化后进行测定，回收率实验证明可排除干扰。

2.6.2 检测波长 人工合成色素常用检测波长254 nm，但不同成分相应值差异较大，检测的灵敏度较差［8］。实验证明，使用254 nm，常有其它杂质峰重叠到被测着色剂峰上无法分离，当变更为485 nm(日落黄)，427 nm(柠檬黄)特征检测波长测定时，即排除干扰，提高响应值，获得更低的检出限。

2.6.3 洗脱方法 采用梯度洗脱，可缩短分析周期，提高分离能力，使峰型得到改善，增加灵敏度。

3 结论

2013年度我单位食品抽检中，抽回非发酵豆制品24批次，其中腐竹14批，豆腐10批，经检验后均未发现违法添加人工合成色素。

［1］易声伟，朱永红，屠大伟，等.高效液相色谱法同时测定饮料中十种着色剂［J］.食品与发酵科技，2013，49(3):68-71.

［2］顾晓莉.HPLC测定食品汇总人工合成色素［J］.吉林农业，2013(4):78.

［3］葛宇.食品中人工合成色素使用法规及检测标准进展［J］.质量与标准化，2011(9):31-35.

［4］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.35—2003食品中人工合成色素的测定［S］.北京:北京标准出版社，2003.

［5］赵亚华，李勇，戎军.食品中9种人工合成色素的高效液相色谱同时检测法［J］.中国卫生检验杂志，2013，23(5):1121-1124.

［6］雷霖.熟肉制品中人工合成色素含量的高效液相色谱测定法［J］.职业与健康，2013，29(2):184-188.

［7］王鑫，黄韬睿.非发酵豆制品中合成着色剂测定方法的研究［J］.生命科学仪器，2012，10(10):26-27.

［8］章家伟，吴公平，黎银波，等.高效液相色谱法测定药用辅料苋菜红的含量［J］.药物分析，2010，30(8):1590-1592.