三氧化二砷对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖的抑制作用*

黄辉，蒋宏玲，刘芬菊，白雪，何卓凯，蔡锐，张荣君，赵博，刘美莲

(1.桂林医学院附属医院放疗科，桂林 541001；2.桂林医学院附属医院康复科，桂林 541001；3.苏州大学放射医学与公共卫生学院，苏州 215007)

·抗肿瘤药物专栏·

三氧化二砷对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖的抑制作用*

黄辉1，蒋宏玲2，刘芬菊3，白雪1，何卓凯1，蔡锐1，张荣君1，赵博1，刘美莲1

(1.桂林医学院附属医院放疗科，桂林 541001；2.桂林医学院附属医院康复科，桂林 541001；3.苏州大学放射医学与公共卫生学院，苏州 215007)

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑胶质瘤SHG44细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法观察As2O3对SHG44细胞的增殖抑制率;激光共聚焦显微镜检测As2O3作用于SHG44细胞后细胞内活性氧自由基(ROS)水平变化。结果As2O3对SHG44细胞增殖具有明显抑制作用,随着As2O3浓度的升高和作用时间的延长,细胞的增殖抑制率升高,12μmol·L-1As2O3对SHG44细胞增殖的抑制率可达63.8%;As2O3可以明显提高SHG44细胞内ROS水平,其ROS水平随As2O3作用浓度的增高明显增高,具有浓度依赖关系。结论As2O3能明显抑制SHG44细胞的增殖,抑制作用呈现剂量依赖性和时间依赖性,其机制与升高细胞内活性氧水平有关。

三氧化二砷；胶质瘤；SHG44细胞；抑制作用

三氧化二砷(As2O3)是砒霜的有效成分,对急性早幼粒细胞白血病的疗效已得到肯定［1-2］。近年来临床医学研究发现中药砷剂具有广泛的抗癌谱,并且不良反应少,As2O3对实体瘤,如结肠癌、肝癌等也有诱导凋亡和抑制生长作用［3-4］。笔者在本研究中探讨了As2O3对人脑胶质瘤SHG44细胞体外增殖的影响,同时探讨其可能的作用机制,为其临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 激光共聚焦显微镜(TCS-SP2型, Leica Co,Germany)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；5 mg·mL-1噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)液25 mg,加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saling,PBS, 0.01 mol·L-1,pH7.4)5 m L搅拌充分溶解后,经孔径0.22μm滤膜过滤除菌,-20℃保存；RPMI 1640培养液(Gibcol):按说明用双蒸水配制,加青霉素、链霉素各100 U·m L-1,碳酸氢钠(NaHCO3)2 g,经孔径0.22μm滤过器除菌,小瓶分装,-20℃储存,临用前加灭活新生小牛血清配成含10%小牛血清的RPMI1640培养液；As2O3,亚砷酸氯化钠注射液(哈尔滨伊达药业有限公司)。10 mL亚砷酸氯化钠注射液含As2O310 mg与氯化钠90 mg。

1.2 细胞培养 SHG44细胞(苏州大学附属第一医院提供)为单层贴壁生长的细胞,培养在含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%二氧化碳(CO2)饱和湿度孵箱中。

1.3 As2O3对SHG44细胞的增殖抑制作用 参照文献方法［5］,取对数生长期细胞加入0.25%胰酶消化,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液,配成5×104个·mL-1细胞悬液,接种于96孔板的6×8孔中,每孔细胞悬液100μL。处理组每孔再加入含不同浓度As2O3完全培养液100μL,使As2O3终浓度分别为1,2,4,6,8, 10,12μmol·L-1,对照组加入等体积10%小牛血清的RPMI 1640培养液,各浓度设6个复孔,37℃、5%CO2孵箱中培养3 d(根据细胞生长曲线实验结果)。取4块96孔板,每板2×6孔加入细胞悬液,每孔细胞0.5×104个,其中每块板1×6孔加入As2O3,终浓度为4μmol·L-1,分别培养1,2,3,4 d后取出。各孔分别加入MTT 20μL,继续培养4 h后吸出培养液,加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)200μL振荡溶解10min,空白对照调零,酶联免疫检测仪上测波长570 nm处吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率,抑制率(%)=［(阴性对照组A值-处理组A值)］/阴性对照组A值］× 100%,绘制细胞增殖抑制曲线。实验重复3次。

1.4 激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡 对数生长期SHG44细胞0.25%胰酶消化成单细胞悬液,50 mL培养瓶中传代培养24 h后换液,处理组每瓶加入含不同浓度As2O3和10%小牛血清的RPMI 1640培养液8 mL,使As2O3终浓度分别为2,4,6μmol·L-1,对照组加入等体积10%小牛血清的RPMI 1640培养液,继续培养72 h,每组设3个平行样品。培养终止,0.25%胰酶消化成单细胞悬液,1 000 r·min-1离心5 min,弃上层液,PBS 100μL混匀细胞沉淀,加吖啶橙(acridine orange,AO))/溴化乙啶(ethidium bromide,EB)染液,使终浓度为5μg·mL-1,37℃孵育5～10 min,激光共聚焦显微镜观察细胞染色及形态(AO激发波长488 nm,发射波长500～520 nm；EB激发波长543 nm,发射波长600～700 nm)。

1.5 激光共聚焦显微镜测定 活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放:①样品的制备:实验分对照组,1,2,4,6μmol·L-1As2O3处理组,SHG44细胞经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,培养于直径25 mm的培养皿中,贴壁2 d,各实验组均换成不含小牛血清的RPMI 1640培养液,其中处理组分别加入As2O3使终浓度为1,2,4,6μmol·L-1,继续培养2 h。②染色:各组分别2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA,终浓度为10μmol·L-1)标记细胞,37℃保温30 min。③激光共聚焦显微镜扫描:将培养皿置于激光共聚焦显微镜下观察。检测选用的激发光波长为488 nm,发射光波长为520 nm,用40倍物镜进行观察,利用含有图像处理系统和自动摄像装置选取不同视野拍摄图像,所有扫描图像存入计算机硬盘内以便分析备用。④激光共聚焦显微镜扫描数据处理:利用Leica自带的软件对存入计算机的图片进行荧光强度分析,使用ROI (Region of Interest)功能对细胞发射的荧光单独获得数值,扣除细胞周边的本底荧光数值,每个剂量点选取3个不同视野进行分析,将不同视野的值汇总以进行统计分析。

2 结果

2.1 As2O3对SHG44细胞的增殖抑制作用 各浓度组As2O3对SHG44细胞均有明显增殖抑制作用,抑制率随浓度升高而明显增加,呈现浓度依赖关系,并发现As2O3浓度为1μmol·L-1时,对SHG44细胞抑制作用已十分明显。统计学结果表明,细胞增殖抑制率(Y)与As2O3浓度(X)呈线性相关,回归方程为:Y= 0.056 57X-0.015 3。从回归方程求得本实验条件下, As2O3的半数抑制浓度为9μmol·L-1。见表1。

单因素方差分析:1和2μmol·L-1As2O3组A值比较,P<0.05,其余各组之间A值比较均差异有统计学意义(P<0.01)

应用SPSS13.0版统计软件包以As2O3浓度为自变量(X),增殖抑制率为因变量(Y),进行曲线估计,得出直线方程模型拟合的决定系数为0.989 3,输出的图形与实际数据的趋势吻合。随后进行线性回归分析,系统输出的模型方差分析结果显示模型的P<0. 01,说明回归方程有效,系统输出回归系数为0.056 57,P<0.01,说明方程中As2O3浓度变量差异有统计学意义。回归方程为:Y=5.657×10-2X-1.530×10-2。

从前面实验得出4μmol·L-1As2O3作用于SHG44细胞后,具有明显的增殖抑制作用(P<0.01),故选用此浓度观察As2O3对SHG44细胞的增殖抑制作用的时间依赖关系。结果4μmol·L-1As2O3第1～4天对SHG44细胞的增殖抑制率分别为(5±2)%,(13±2)%,(20± 3)%,(21±4)%。在第1～3天随作用时间的延长,细胞的抑制率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01)。第4天和第3天抑制率差异无统计学意义,是因为本实验条件下,细胞培养于96孔板中,第3天细胞已贴满板底,生长处于停滞期。实验表明,As2O3对SHG44细胞的增殖抑制作用具有时间依赖关系。

表1 不同浓度As2O3作用后各组MTT吸光度(A)值和SHG44细胞增殖抑制率Tab.1 Absorbance values(A)of MTT and inhibition rate on SHG44 cell proliferation after treatment with different concentrations of As2O3 ±s

表1 不同浓度As2O3作用后各组MTT吸光度(A)值和SHG44细胞增殖抑制率Tab.1 Absorbance values(A)of MTT and inhibition rate on SHG44 cell proliferation after treatment with different concentrations of As2O3 ±s

As2O3浓度/ (μmol·L-1)A值抑制率/ % 0 1.05±0.03 0.0 1 0.99±0.02 5.7 2 0.97±0.02 7.6 4 0.85±0.05 19.0 6 0.71±0.04 32.4 8 0.55±0.02 47.6 10 0.44±0.01 58.1 12 0.38±0.02 63.8

2.2 激光共聚焦显微镜观察As2O3诱导的细胞凋亡 对照组,2,4,6μmol·L-1As2O3实验组细胞AO/EB染色后激光共聚焦显微镜观察,出现:①对照组大部分为活细胞,核染色质着绿色,核呈正常结构(图1-A)；②早期凋亡细胞,核染色质着绿色,胞核呈固缩状或碎裂状(图1-B)；③中期凋亡细胞,核染色质着黄绿色,胞核呈固缩状或碎裂状(图1-C)；④晚期凋亡细胞,核染色质着橘红色,胞核呈固缩状或碎裂状(图1-D)；⑤坏死细胞,核染色质着橘红色,胞核结构正常(图1-D)。

2.3 As2O3提高SHG44细胞内ROS水平 细胞内ROS测定参照方法［6］进行,DCFH-DA自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH,在ROS存在下被氧化成DCF, DCF荧光强度与细胞内ROS水平呈正比。细胞经0,1, 2,4,6μmol·L-1As2O3处理后,SHG44细胞内荧光强度值分别为51.41±4.83,85.06±9.86,149.98±10.03, 188.33±10.65,244.47±6.46。细胞内荧光强度反映细胞内ROS水平。可以看出,细胞内的ROS水平与As2O3在0～6μmol·L-1的浓度内有明确的浓度依赖关系, ROS的含量随As2O3作用浓度的增高明显增高,对照组和各作用组及各作用组间比较,差异均具有统计学意义(图2:细胞内荧光强度随As2O3作用浓度的增高明显增强)。

3 讨论

As2O3是中药砒霜的主要成分,砷与蛋白质氨基酸中的巯基具有强效的亲和性,可直接影响细胞内许多蛋白质的功能。As2O3注射液已成功用于治疗急性早幼粒细胞白血病［7］。近年来,研究表明,As2O3对多种实体瘤也有抑制作用,其机制为诱导肿瘤细胞分化和凋亡［8］。国内外的流行病学调查和实验研究均表明,As2O3对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、白血病等多种肿瘤也均有明显抑制作用［9-14］。也有研究表明As2O3对人宫颈癌Hela细胞、口腔鳞状细胞癌等有明显的放射增敏作用［15-17］。本实验研究As2O3对人脑胶质瘤SHG44细胞的增殖抑制作用,结果表明,As2O3能抑制SHG44细胞的生长,并呈剂量依赖性和时间依赖性,即随As2O3作用浓度的增加、As2O3作用时间的延长,其抑制作用越明显,其半数抑制浓度为9μmol·L-1。可以从As2O3对SHG44细胞的增殖抑制作用看出,当As2O3浓度为1μmol·L-1时,对SHG44细胞已有抑制增殖作用(P<0.01),在1～4μmol·L-1浓度时,抑制作用呈递增关系,这个浓度是临床治疗剂量的砷浓度。

图1 4组细胞激光共聚焦显微镜扫描凋亡图(×40)A.对照组;B.2μmol·L-1As2O3组;C.4μmol·L-1As2O3组;D.6μmol·L-1As2O3组Fig.1 Apoptosis images by laser scanning confocalm icroscope of 4 groups of cells(×40)A.control group;B.2μmol·L-1As2O3group;C.4μmol·L-1As2O3group;D.6μmol·L-1As2O3group

图2 5组细胞内荧光强度图(×40)A.对照组;B.1μmol·L-1As2O3组;C.2μmol·L-1As2O3组;D.4μmol·L-1As2O3组;E.6μmol·L-1As2O3组Fig.2 Intracellular fluorescence intensity images of five groups of cells(×40)A.control group;B.1μmol·L-1As2O3group;C.2μmol·L-1As2O3group;D.4μmol·L-1As2O3group;E.6μmol·L-1As2O3group

有关As2O3对细胞杀伤机制的基础研究报道甚多,笔者从ROS的氧化损伤角度来研究其细胞杀伤机制。As2O3在0～6μmol·L-1的浓度作用于SHG44细胞,激光共聚焦显微镜测定细胞内的荧光强度,荧光强度与细胞内ROS水平成正比,间接反映细胞内的ROS水平,当加入As2O3后,SHG44细胞内荧光强度值明显升高,ROS的含量随As2O3作用浓度的加大明显提高,具有一定的浓度依赖关系。As2O3是一种原浆毒物质,与巯基(-SH)有高度亲和力。可以与细胞内含巯基的抗氧化剂和抗氧化酶结合,细胞清除和拮抗氧化能力降低,打破细胞内抗氧化的动态平衡,致使细胞内ROS增多。过高的ROS对细胞生长不利,可以导致包括脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等有害变化。DNA是生命信息的载体,是细胞中最重要的生物大分子之一。细胞DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键都可能遭受自由基的攻击,造成碱基与核糖氧化、链断裂与蛋白质交联等多种类型的损伤。

综上所述,As2O3在体外具有抗胶质瘤细胞增殖作用。这为临床应用As2O3治疗胶质瘤提供较可靠的实验依据。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.010

Inhibition Effects of Arsenic Trioxide on SHG44 Human Glioma Cells

HUANG Hui1,JIANG Hong-ling2,LIU Fen-ju3,BAI Xue1,HE Zhuo-kai1,CAI Rui1,ZHANG Rong-jun1, ZHAO Bo1,LIU Mei-lian1
(1.Department of Radiation Oncology,Affiliated Hospital to Guilin Medical College, Guilin 541001,China;2.Department of Rehabilitation,Affiliated Hospital to Guilin Medical College,Guilin 541001,China;3.School of Radiation Medicine and Public Health,Suzhou University,Suzhou 215007, China)

Objective To investigate the anti-proliferation effects of arsenic trioxide(As2O3)on human glioma cells-44 (SHG44)in vitro and itsmechanism.MethodsThe inhibitory ratio of the cells by As2O3wasmeasured by MTT assay.The intracellular ROSwere determined by a probe(DCFH-DA)under a laser scanning confocalmicroscopy.ResultsAs2O3significantly inhibited SHG44 cells proliferation.The proliferation inhibition rate was dose-dependent and time-dependent.The proliferation inhibition by 12μmol·L-1As2O3on SHG44 cells was as high as 63.8%.After treatment with As2O3,the intracellular ROS was increased markedly in a concentration-dependent manner.ConclusionAs2O3can inhibit the proliferation of SHG44 cells in both dose-dependent and time-dependentmanners.The inhibition was associated with elevation of intracellular ROS.

Arsenic trioxide;Glioma;SHG44 cells;Inhibition effects

R979.1;R969

A

1004-0781(2014)01-0034-05

2013-04-01

2013-07-11

*广西卫生厅自筹经费科研课题基金资助项目(Z2011185)

黄辉(1974-),男,湖南安化人,副主任医师,硕士,研究方向:肿瘤放射治疗和综合治疗。电话：(0) 15878398556,E-mail：huanghui25002@163.com。

蒋宏玲(1978-),女,湖南衡阳人,主管护师,学士,从事肿瘤康复工作。电话：(0)13977312871,E-mail：1037039186@qq.com。