紫红参提取物灌胃给予大鼠后入血成分研究*

邱楠楠，刘金平，卢丹，李平亚

(吉林大学再生医学科学研究所，长春 130021)

紫红参提取物灌胃给予大鼠后入血成分研究*

邱楠楠，刘金平，卢丹，李平亚

(吉林大学再生医学科学研究所，长春 130021)

目的 分析紫红参提取物入血成分,探讨紫红参提取物的药效物质基础。方法对大鼠灌胃给予紫红参提取物后,收集血清样品,采用超高效液相色谱-电喷雾质谱联用(UPLC-ESI-MS/MS)法,鉴定灌胃紫红参后大鼠血清中的移行成分。结果大鼠含药血清中检测到了14种入血成分,其中6种为紫红参提取物中原型吸收入血的成分,其余入血成分可能为代谢产物或机体吸收紫红参后产生的应激性成分。结论紫红参14种入血成分可能是其体内直接作用物质,对其进行深入研究将有助于揭示紫红参的药效物质基础及药效机制。

紫红参；药效成分；药物化学

人参(Panaχ ginsengC.A.Mey)为五加科人参属多年生宿根草本植物,其性温、味甘,具有大补元气、强心固脱、安神生津等功效,被誉为“百草之王”,具有很高的药用价值。现代临床医学和药理学研究表明,人参具有提高机体免疫力［1］、抗抑郁［2］、抗疲劳［3-4］、抗肿瘤［5］、抗血栓［6］、抗炎［7］以及改善记忆力［8］等多种活性。紫红参(又称活性人参)是将人参反复蒸制烘干而得到的一种人参深加工产品。在将人参炮制加工成紫红参的过程中,部分化学成分会发生变化,产生一些稀有皂苷(元)。对紫红参的药理活性研究表明,紫红参具有抗肿瘤［9］、壮阳等活性作用。笔者采用超高效液相色谱-电喷雾质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry, UPLC-ESI-MS/MS)法对紫红参的血清药物化学进行了初步研究,通过检测紫红参的入血成分来确定其药效物质基础,为进一步研究紫红参的作用机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠,雄性,体质量210～250 g,由吉林大学实验动物部提供,质量合格证号:医动字第10-5110号。

1.2 药品及试剂 紫红参(吉林省皇封参集团股份有限公司,批号:100116)；乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Fisher公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。

1.3 仪器 Waters Xevo TQ-S液质联用色谱仪(美国Waters公司)；N110 dR型氮气发生器；SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DCY-12S型氮吹仪(青岛海科仪器有限公司)；FA11O4N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；RCT-3200型超纯水仪(长春博莱帕特科技发展有限公司)；飞鸽超离速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm)色谱柱；柱温:30℃；样品管理器温度:15℃；流速:0.3 mL·min-1；进样量: 4μL；流动相A(0.1%甲酸)-B(乙腈),梯度洗脱,洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子化源(ESI),负离子检测模式。扫描范围:m/z 100～1 500。毛细管电压: 3.0 kV；锥孔电压:40 V；源温度:150℃；脱溶剂气温度:400℃；锥孔气流量:150 L·h-1；脱溶剂气流量: 800 L·h-1；氩气流量:0.15 mL·min-1。

1.5 紫红参提取物及灌胃药液的制备

1.5.1 紫红参提取物及其供试品溶液的制备 称取紫红参1 kg,用70%乙醇加热回流提取3次,每次3 h,合并提取液,减压浓缩至无醇味,经真空干燥后得其粉末。取紫红参粉末(过孔径250μm筛)0.5 g,精密称定,精密加入甲醇25 mL,称定质量,密塞,超声处理(功率100 W,频率40 kHz)45 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,过孔径0.22μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

1.5.2 灌胃药液的制备 取紫红参提取物粉末,加水溶解,使配制成溶液浓度分别为26.4,52.8,66.0, 132.0 mg·mL-1

1.6 入血成分分析的前期条件优化

1.6.1 给药剂量的确定取10只大鼠,分为空白组2只,给药组8只。大鼠于实验前禁食12 h,自由饮水。空白组给予0.9%氯化钠溶液,给药组选择4个剂量给药,分别为0.30,0.60,0.75,1.50 g·kg-1,每个剂量2只大鼠。灌胃4 h后,用乙醚将大鼠麻醉,麻醉后腹主静脉取血。置于10 mL EP管中,静置60 min后,以4 000 r·min-1离心20 min,取上清液。取0.1 mL上清液加入4倍体积的甲醇沉淀后,涡旋混匀3 min,将混合液在4 000 r·min-1下离心20 min,除去蛋白质,吸取上清液,氮气吹干。所得残渣用甲醇0.1 mL复溶,过孔径0.22μm微孔滤膜,即得,进样分析。结果表明,当给药剂量为1.50 g·kg-1时,总离子流色谱图效果最好,入血成分峰最多,且峰面积增加,适合对入血成分进行分析。因此,确定大鼠灌胃给药的最佳剂量为1.50 g·kg-1。

1.6.2 取血时间的筛选 将供试的4只大鼠随机分为空白组和给药组。给药组以1.50 g·kg-1大鼠体质量的剂量对大鼠进行灌胃,空白组给予同体积0.9%氯化钠溶液。给药前禁食12 h,自由饮水。分别于给药后1,2,3,4,5 h用乙醚将大鼠麻醉,眼眶静脉窦取血0.5 mL,分别滴置于离心管中。血样处理方法同上。结果表明,当取血时间为给药后4 h,入血成分谱中峰的个数最多,且峰强度最好,适宜做进一步分析。

2 结果

2.1 紫红参的正、负离子检测模式总离子流图 采集紫红参提取物的正、负离子模式下的离子流色谱图,见图1,2。

2.2 大鼠血清色谱图的建立 选择大鼠给药剂量为1.50 g·kg-1,取血时间为给药后4 h,收集血清样品,分别采集正、负离子模式下的离子流色谱图,见图3, 4。

2.3 入血成分的鉴定

2.3.1 原型化合物的鉴定 对比观察给药后血清和空白血清的离子流色谱图,发现将血清中的内源性成分扣除掉以后,紫红参入血成分的负离子检测模式总离子流图中,含药血清比空白血清多了10个色谱峰；紫红参入血成分的正离子检测模式总离子流图中,含药血清比空白血清多了4个色谱峰。化合物数据见表2。将这14个色谱峰和紫红参提取物的谱图进行对照,发现其中的6个峰也存在于紫红参提取物中,因此可以推测这6个成分为原型入血成分。

图1 紫红参的正离子检测模式总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of purplish red ginseng by mass spectrometry(ESI+)

图2 紫红参的负离子检测模式总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of purplish red ginseng by mass spectrometry(ESI-)

图3 空白血清和紫红参入血成分的负离子检测模式总离子流图A.空白血清;B.紫红参Fig.3 Total ion chromatogram of blank serum and com ponents of purp lish red ginseng absorded into blood by mass spectrometry(ESI-)A.blank serum;B.purplish red ginseng

图4 空白血清和紫红参入血成分的正离子检测模式总离子流图A.空白血清;B.紫红参Fig.4 Total ion chromatogram of blank serum com ponents of purp lish red ginseng absorded into blood by mass spectrometric(ESI+)A.blank serum;B.purplish red ginseng

表2 紫红参入血成分的UPLC-ESI-MS/MS鉴定结果Tab.2 UPLC-ESI-M S/MS identification results on components of purplish red ginseng absorded into blood

2.3.2 代谢产物的鉴定 化合物M5:m/z603.4［MH］-,对比保留时间,初步确定其为人参皂苷Rg5/Rk1在体内失去一分子葡萄糖的降解产物。

3 讨论

皂苷类药物口服吸收率低,入血含量微少,以往常采用高效液相色谱-蒸发光散射法和反相高效液相色谱法对入血成分进行检测,但灵敏度都不如UPLCESI-MS/MS法,而且前两者进行定性分析时需要对照品,而本实验采用的UPLC-ESI-MS/MS法具有高效能、高灵敏度、高专属性,并且能通过相对分子质量进行定性分析。

笔者通过优化紫红参的给药剂量和取血时间条件,建立了紫红参血清药物化学的分析方法。采用UPLC-ESI-MS/MS方法对紫红参提取物给药血清和空白血清进行了对比分析,从大鼠含药血清中共检测到14种入血成分。包括:电喷雾离子化源(ESI),负离子检测模式下检测出10种成分(表2),根据UPLC-ESIMS/MS结果结合文献报道,鉴定了其中3种化学成分,分别为20(S)-原人参皂苷Rg3、姜状三七苷R1、人参皂苷M5。其中,20(S)-原人参皂苷Rg3和姜状三七苷R1为原型药物。人参皂苷M5为代谢产物,结合紫红参提取物的UPLC-ESI-MS/MS图谱和该成分的分子结构,判断其为人参皂苷Rg5/Rk1在体内的降解产物。另在大鼠含药血清中未检测出紫红参提取物中含量较高的人参皂苷Ro成分,但检测出姜状三七苷R1,结合二者的分子结构,故推断人参皂苷Ro在体内可能以其降解产物——姜状三七苷R1形式被吸收入血。

电喷雾离子化源(ESI),正离子检测模式下检测出4种成分(表2),根据UPLC-ESI-MS/MS结果结合文献报道,鉴定了其结构,分别为20(S)-原人参三醇、20 (R)-原人参三醇、20(S)-原人参二醇和20(R)-原人参二醇,均为原型药物。

大鼠含药血清中还检测到其余7种入血成分,可能是紫红参提取物在体内的代谢转化或机体灌服吸收紫红参后产生的应激性成分。

综上所述,采用血清药物化学的研究方法,对紫红参的入血成分进行了研究,明确了紫红参提取物的药效物质基础,为其在临床上的广泛应用奠定了理论基础。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.005

Com ponents Study in Rat Blood After Oral Adm inistration of Extracts from Purplish Red Ginseng

QIU Nan-nan,LIU Jin-ping,LU Dan,LI Ping-ya
(Institute of Frontier Medical Science of Jilin University, Changchun 130021,China)

Objective To analyze components absorbed in the blood of extracts from purplish red ginseng and illustrate its effective substance.MethodsThe serum sample was collected after oral administration of the extract of purplish red ginseng in rats,and the shift componentswere identified by UPLC-ESI-MS/MS.ResultsFourteen transitional components in rat′s serum were detected,six were constituents absorbed in blood in prototype of extracts and the othersmight be irritability compositions ormetabolites of purplish red ginseng in blood.ConclusionThe fourteen constituents absorbed into blood may be the bioactive components that act directly on the body,laying a foundation for studing active components and therapeutic mechanism of purplish red ginseng.

Purplish red ginseng;Ingredient;Pharmacochemistry

R284;R285.5

A

1004-0781(2014)01-0016-04

2013-02-18

2013-06-21

*吉林省科技厅重大项目(20096039)

邱楠楠(1985-),女,辽宁昌图人,博士,研究方向:天然药物化学成分及其生物活性研究。电话：(0) 13943007632,E-mail：qiunn10@mails.jlu.edu.cn。

李平亚(1957-),男,吉林公主岭人,教授,博士生导师,研究方向:天然药物化学成分及其生物活性研究。电话：0431-85619803,E-mail：lipy@jlu.edu.cn。