固相萃取高效液相色谱法测定全血环孢素浓度

2014-05-13 09:55宋新文汪洋刘炘彭静许琼
医药导报 2014年1期
关键词:柱温环孢素全血

宋新文,汪洋,刘炘,彭静,许琼

(武汉市妇女儿童医疗保健中心,武汉 430016)

固相萃取高效液相色谱法测定全血环孢素浓度

宋新文,汪洋,刘炘,彭静,许琼

(武汉市妇女儿童医疗保健中心,武汉 430016)

目的 建立一种简便的测定全血环孢素浓度的高效液相色谱法。方法以Venusil ASB C18为色谱柱,流动相为乙腈-水=70∶30,柱温70℃,检测波长为210 nm,进样量200μL;全血样品经10%尿素溶血处理离心后,取上清液直接上PRS-SPE柱,用等体积乙腈-四氢呋喃(80∶20)作为洗脱剂,收集洗脱液直接进样测定。结果环孢素全血样品线性范围为30~3 500 ng·mL-1,低、中、高3种不同浓度(78.2,300.0,1 213.0 ng·mL-1)方法回收率分别为101.66%,104.06%,100.46%,日内、日间RSD均<5%。结论该方法准确性好,灵敏度高,样品处理简单,可满足儿科临床中环孢素全血浓度监测需要。

环孢素;固相萃取;色谱法,高效液相

环孢素是临床上常用的免疫抑制药,在成人主要用于器官移植后抗免疫排斥,在儿科临床上多用于重型再生障碍性贫血和难治性肾病综合征的治疗,也可用于系统性红斑狼疮、噬血细胞综合征等其他免疫性疾病。但是环孢素毒副作用大,治疗窗较窄,药物吸收个体差异大,临床上往往需要通过监测其血药浓度来实行个体化用药,以减少其肝、肾毒性等不良反应和提高治疗效果。因此,开发和建立一种能够快速、准确地测定血液中环孢素浓度的检测技术以指导安全合理使用环孢素就具有十分重要的临床价值。

目前国内外测定环孢素血药浓度的方法主要有荧光偏振免疫法和高效液相色谱法(HPLC)[1]。荧光偏振免疫法简便、快速、灵敏,但其测定成本昂贵(需要依赖专用试剂),且该法易受代谢产物因素的干扰而使测定结果误差较大。HPLC法具有特异性强、准确度高、成本低廉、易于推广普及等优点,但文献报道[2~4]大多采用液液萃取法等多重步骤提取,操作比较复杂,难以适应临床常规监测的需要。为此笔者通过固相萃取处理样品建立了HPLC法测定全血环孢素,用于小儿再生障碍性贫血及激素耐药型肾病综合征(难治性肾病)患儿环孢素全血浓度的监测,取得了满意效果,现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪:包括G1311C二元色谱泵、G1316A柱恒温箱、G1315D二极管阵列紫外检测器(DAD)、Agilent1260化学工作站;WH-1微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);LDZ4-0.8A台式离心机(北京医用离心机厂);AB204万分之一电子分析天平(瑞士产);Cleanert PRS丙磺酸强阳离子交换固相萃取柱(规格:每支200 mg;Agela Technologies公司生产)。

1.2 试药 环孢素对照品(上海梯希爱化成工业发展有限公司,批号:K4J6E-DA);乙腈(国药集团化学试剂有限公司,批号:20120629,色谱纯);正常空白全血(实验室自制);0.9%氯化钠注射液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司,批号:120704-201);尿素(天津鸿鑫化学试剂有限公司,批号:20110803),四氢呋喃(天津市光复精细化工研究所,批号:20120305)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Venusil ASB C18(4.6 mm× 200 mm,10μm);流动相为乙腈∶水=70∶30;流速0.8 mL·min-1;柱温70℃;检测波长为210 nm;进样量200μL。

2.2 标准溶液的制备 精密称取环孢素对照品3.832 mg,用70%乙腈定容于10 m L量瓶,再取1 mL用70%乙腈定容于10 mL量瓶中,得到浓度为38.32μg·mL-1的对照液,作为①号对照液,然后按照倍比稀释原则依次稀释到⑧号,①~⑧号对照液浓度分别为38.32,19.16,9.58,4.79,2.40,1.20,0.60, 0.30μg·mL-1。

2.3 全血标本的处理 取全血样品0.5 mL,加入10%尿素溶液1 mL,混合均匀,经12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液于PRS固相萃取小柱,待其自然沥干后加入0.9%氯化钠注射液3 mL进行淋洗,将固相萃取小柱于4 000 r·min-1离心2 min,最后用洗脱液(乙腈∶四氢呋喃=80∶20)0.5 m L上柱洗脱,收集洗脱液,取200μL进样测定。

2.4 标准品和全血标本色谱图 分别取空白全血样品、含环孢素全血样品及环孢素标准品进样测定,记录色谱图。结果环孢素色谱峰与全血中内源性杂质峰能够很好分离,无干扰峰出现,环孢素的保留时间约13 min,环孢素标准品、空白全血、含环孢素样品及色谱图见图1。

图1 3种样品的HPLC图A.空白全血;B.环孢素标准液;C.含环孢素全血样品; 1.环孢素Fig.1 HPLC chromatogram of 3 kinds of sam p lesA.blank whole blood;B.cyclosporine standard solution; C.whole blood sample containing cyclosporine;1.cyclosporine

2.5 标准曲线制备 依次量取上述①~⑧对照液各0.1 mL加入到空白全血1 m L中,漩涡混合均匀,可得浓度依次为27.27,54.54,109.10,218.20,435.50, 870.70,1 741.80,3 483.60 ng·mL-1的工作全血标本,分别取0.5 mL按“2.3全血标本的处理”项下进行处理,记录色谱峰面积,以峰面积A为横坐标,以对照液浓度(C)为纵坐标,得直线回归方程为C=A×3.1-0.5,r=0.999 9,最低检测浓度为27 ng·mL-1

2.6 回收率及精密度实验 分别配制低(78.2 ng·m L-1)、中(300.0 ng·m L-1)、高(1 213 ng·m L-1)3种不同浓度的环孢素全血样品,每种浓度的样品各取3份,照“2.3”项下操作,记录色谱峰面积,如此连续操作3 d,根据工作标准曲线方程分别计算日内回收率及日间回收率,结果见表1。

表1 环孢素回收率和精密度测定结果Tab.1 Recovery and precision results of cyclosporine %

2.7 临床标本检测结果 32例次难治性肾病患儿及10例次再生障碍性贫血患儿,按4~8 mg·kg-1·d-1、每12 h 1次口服环孢素口服溶液,分别取服药前全血样本(谷浓度)及服药2 h后全血样本(峰浓度)测定,结果见表2。

表2 临床标本检测结果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

表2 临床标本检测结果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

项目例次谷浓度峰浓度难治性肾病32 71.6±41.7 559.8±143.3再生障碍性贫血10 155.5±66.4 1 125.0±343.1

3 讨论

3.1 色谱条件的确立 环孢素是一种内含11个氨基酸的环状多肽化合物,紫外吸收较弱,文献[2~6]均以210 nm作为检测波长,故本实验也采用此波长。

由于环孢素相对分子质量大,脂溶性高,采用C18反相色谱柱分离时需用较高的柱温才能使其有效分离,否则峰形很宽,呈丘陵状。本实验分别尝试50, 55,60,65,70℃柱温,发现随着柱温升高,峰宽逐步减小,峰形改善明显,考虑到柱温太高会影响色谱柱寿命,故最终确定柱温为70℃。本研究使用的天津博纳艾杰尔公司生产的Venusil ASB C18色谱柱,在80℃柱温条件下可以连续使用100 h,故在70℃条件下间断运行是完全可行的。

环孢素在全血中的浓度较低,在激素耐药型肾病综合征(难治性肾病)患儿其有效谷浓度一般维持为100~200 ng·mL-1[7],而在再生障碍性贫血患儿有效谷浓度为200~400 ng·mL-1[8],因此,提高全血中环孢素的最低检测限尤为关键。文献大多采用将全血标本提取后浓缩5~10倍,以提高进针样品中环孢素的浓度的办法,而仪器进样量仍采用通常体积20μL[2~6]。本研究在实验过程中也曾采用过此类方法,但结果仍不理想,主要是存在最低检测限仍然不能满足儿科临床实际标本需要的缺点。受文献[9]启发,实验过程中采用全血标本等体积提取(0.5→0.5 m L),200μL大体积进样,结果发现可以克服上述不足,最低检测限可达27 ng·mL-1,故确定进样量为200μL。

3.2 全血中红细胞膜处理 环孢素在血液中41%~58%分布在红细胞中[1],所以测定全血中环孢素的浓度时需要对全血样品进行溶血预处理,一般采用氢氧化钠、氟化钠或十二烷基硫酸钠破坏红细胞,以保证有机溶剂对环孢素的萃取率[10]。尿素分子能够自由进入到红细胞内,利用渗透压原理,本实验采用10%尿素溶液加入到全血标本中以破坏红细胞,高速离心后可见管底有一薄层膜状物,吸取上清液上固相萃取柱,过柱速度基本令人满意。

3.3 固相萃取小柱的选择 实验过程中分别尝试用C8柱、C18柱、氨基柱、氰基柱、羧基柱等不同填料的固相萃取小柱,以甲醇或乙腈作为洗脱剂,结果均不满意,内源性杂质较多,不能与环孢素达到有效分离。采用丙磺酸强阳离子型(PRS)固相萃取小柱,以“乙腈∶四氢呋喃=80∶20”作为洗脱剂,在环孢素色谱峰附近基本无内源性杂质干扰,故确定PRS小柱为环孢素全血标本处理固相萃取柱。

本研究建立的环孢素全血浓度测定方法,样品处理简单,准确度高,特异性好,用于儿科难治性肾病及再生障碍性贫血环孢素血药浓度监测,结果令人满意,值得推广。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.009

Determination of Cyclosporin in Whole Blood by Solid-Phase Extraction and High Perform ance Liquid Chromatography

SONG Xin-wen,WANG Yang,LIU Xin,PENG Jing,XU Qiong
(Women and Children Health Care Center in Wuhan City,Wuhan 430016,China)

Objective To establish a simple high-performance liquid chromatography(HPLC)method to determinate cyclosporin in whole blood.MethodsThe HPLC was carried out by using Venusil ASB C18column,acetonitrile/water(70∶30)as a mobile phase,setting column temperature at 70℃,detection wavelength at 210 nm.Whole blood samples were centrifugated after treated with 10%urea for hemolysis.Two hundred microliters of the supernatantwas directly injected into the PRS-SPE column,using equal volume of acetonitrile/tetrahydrofuran(80∶20)as the eluent.ResultsThemethod is linear at 30 to 3 500 ng·mL-1curve range.The recoveries at low,medium and high concentrations(78.2,300.0,1 213.0 ng· mL-1)were 101.66%,104.06%and 100.46%,respectively.The intra-and inter-day RSD were less than 5%.ConclusionThemethod isaccurate,sensitive,and the sample iseasy to handle,fullymeeting the requirementof pediatric clinical practice for determination of cyclosporin in whole blood.

Cyclosporin;Solid phase extraction;Chromatography,high performance liquid

R979.5;R969

A

1004-0781(2014)01-0031-03

2013-03-18

2013-05-06

宋新文(1968-),男,湖北武汉人,副主任药师,研究方向:治疗药物监测及儿科临床药学。电话:(0) 13797028603,E-mail:13797028603@126.com。

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