咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠系膜细胞p27的影响*

秦福芳，孙倩，邵凤民

(1.郑州人民医院特需科，郑州 450003；2.河南省人民医院肾内科，郑州 450003)

咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠系膜细胞p27的影响*

秦福芳1，孙倩1，邵凤民2

(1.郑州人民医院特需科，郑州 450003；2.河南省人民医院肾内科，郑州 450003)

目的 观察咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠系膜细胞p27的影响。方法雄性SD大鼠90只,分为5组:正常组、模型组、咪唑立宾组、咪唑立宾+氯沙坦组、氯沙坦组,正常组10只,其余各组每组20只。肾炎诱导后第1,3,5,7天取肾脏组织;过碘酸希夫(PAS)染色评估系膜细胞增殖;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测p27基因表达水平;免疫印迹法(Western blot)检测p27蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组系膜细胞明显增殖,p27蛋白表达水平显著减少(P<0.05);与模型组比较,3个治疗组的系膜细胞增殖程度明显减轻(P<0.05),p27蛋白表达水平显著增加(P<0.05);咪唑立宾或咪唑立宾联合氯沙坦的治疗作用显著优于单独应用氯沙坦(P<0.05)。结论咪唑立宾与氯沙坦均可抑制系膜细胞增殖,且咪唑立宾的作用较氯沙坦强,咪唑立宾能够通过上调p27蛋白表达,从而抑制系膜细胞增殖。

咪唑立宾；Thy1肾炎；系膜细胞；p27

临床上许多肾小球疾病的病理特征均表现为系膜细胞增殖,因此研究如何抑制系膜细胞增殖具有重要意义。咪唑立宾(mizoribine,MZ)是一种免疫抑制药,对异常增殖的细胞及各种有丝分裂素引起的细胞分裂具有抑制作用［1］。研究表明咪唑立宾能抑制系膜细胞增殖［2］,p27与系膜细胞增殖成负相关［3］；咪唑立宾抑制系膜细胞增殖是否与p27有关？笔者尚未见相关报道,故在本实验中制备了急性Thy1肾炎动物模型［4］,观察咪唑立宾对系膜细胞p27的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠,购自郑州大学实验动物中心,体质量:140～160 g；OX-7单克隆抗体(解放军总医院肾脏病研究所惠赠)；咪唑立宾(日本旭化成制药株式会社提供,批号:H2010122),氯沙坦(杭州默沙东制药有限公司生产,批号:09022)；大鼠抗小鼠p27单克隆抗体(sc-10621)；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(AP021)。引物序列:上游5′-GCA GCT TGC CCG AGT TCT AC-3′,下游5′-TTC TTG GGCGTC TGC TCC AC-3′。

1.2 实验设计与动物模型制备 雄性Wistar大鼠90只,随机分为5组:正常组(10只)、模型组(20只)、咪唑立宾组(20只)、咪唑立宾+氯沙坦组(20只)、氯沙坦组(20只)。模型组与治疗组给予尾静脉注射OX-7单克隆抗体(100 mg·kg-1)；正常组注射等量0.9%氯化钠注射液。注射后6 h开始灌胃给药,连续给药7 d。具体组别及给药方案如下,正常组:纯化水；模型组:纯化水；咪唑立宾组:咪唑立宾(20 mg·kg-1)；氯沙坦组:氯沙坦(200 mg·kg-1)；咪唑立宾+氯沙坦组:咪唑立宾(20 mg·kg-1)+氯沙坦(200 mg·kg-1)。病理检查结果显示:系膜细胞重度增殖,表明造模成功［4］。

1.3 标本留取 各组大鼠于肾炎诱导后第1,3,5,7天各时间点取肾组织。所取肾组织分别用于过碘酸希夫(periodic acid schiff,PAS)染色、直接免疫荧光检测、RNA、蛋白质提取及逆转录-聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot等分析。

1.4 肾脏常规病理 采用PAS染色,光镜观察,对肾小球内有核细胞数进行计数,每个标本400倍光镜下观察100个肾小球。免疫荧光检测p27阳性细胞数。

1.5 RT-PCR检测p27mRNA水平 按Trizol试剂盒说明书一步法提取肾组织总RNA,取总RNA 10μg逆转录合成cDNA,取cDNA1μL扩增p27的基因片段。PCR总反应体系25μL,含cDNA模板1μL,10×Buffer 2.5μL,2.5 mmol dNTP 1.5μL,25 mmol·L-1氯化镁(MgCl2)2.0μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,上游及下游引物各0.25μL,加去离子消毒水补至25μL。扩增条件p27:95℃变性45 s,62℃退火45 s,72℃7 min延伸,28个循环；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):95℃变性45 s, 58℃退火45 s,72℃7 min延伸,26个循环。置于1.2%琼酯糖凝胶,电泳。以GAPDH为内参照。采用GDS8000凝胶图像分析系统进行灰度扫描分析,计算p27的mRNA及GAPDH-mRNA的比值。

1.6 Western blot检测p27的蛋白水平 提取肾组织总蛋白质:将冻存肾组织100 mg加入预冷的组织细胞裂解液及蛋白酶抑制剂,匀浆,冰浴1 h,分装于EP管各约500μL,12 000 r·min-1(r=8 cm)离心15 min, 4℃,取中间层液体,即为所提蛋白。取蛋白100μg上样；进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干法转移至聚氟乙烯膜上,加入小鼠p27单克隆抗体(1∶200),4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG (1∶2 000)作为二抗,室温摇床1 h。电化学发光法显影。β-actin作为内参照,采用Alphaimager 2200凝胶图像分析系统进行半定量分析。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组、模型组及氯沙坦组大鼠均无明显异常,体质量逐渐增加。咪唑立宾组及咪唑立宾+氯沙坦组体质量增长稍缓慢,但与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠肾脏病理分析结果 正常组、模型组、咪唑立宾组、氯沙坦组和咪唑立宾+氯沙坦组大鼠肾小球内系膜细胞数分别为(70±8),(130±10),(89± 9),(101±7),(93±8)个。与正常组比较,模型组第4至6天系膜细胞明显增殖(t=16.48,P<0.01)。咪唑立宾组及氯沙坦组系膜细胞增殖显著减少(P<0.05)。

2.3 p27mRNA的表达 第3天,各组大鼠之间p27mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 5组大鼠第3天p27mRNA表达A.正常组;B.模型组;C.咪唑立宾组;D.咪唑立宾+氯沙坦组;E.氯沙坦组Fig.1 p27m RNA expression on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. m izoribine plus losartan group;E.losartan group

2.4 p27蛋白的表达 第3天,与正常组比较,模型组p27蛋白表达显著减少(t=2.47,P<0.05)；与模型组比较,咪唑立宾组、咪唑立宾+氯沙坦组及氯沙坦组p27蛋白表达显著增加(t=10.8,t=6.32 t=4.62,P< 0.05)。见图2。

2.5 各组大鼠p27阳性细胞免疫荧光染色 第3天,与正常组比较,模型组p27阳性细胞数显著减少(t= 2.57,P<0.05)；与模型组比较,咪唑立宾组、氯沙坦组、咪唑立宾+氯沙坦组p27阳性细胞数显著增加(P< 0.05)。见图3。

3 讨论

咪唑立宾是一种免疫抑制药,竞争性抑制嘌呤合成系统中的肌苷酸至鸟苷酸途径,能够抑制各种分裂素引起的细胞分裂［1］。体外研究发现咪唑立宾能够抑制系膜细胞增殖［5］。氯沙坦是一种血管紧张肽Ⅱ受体拮抗药,它对系膜细胞增殖的抑制作用已经得到公认,并被应用于系膜增生性肾小球肾炎［6-7］。故本实验将氯沙坦作为阳性对照药。观察咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠系膜细胞增殖的影响。

图2 5组大鼠第3天肾组织内p27蛋白表达A.正常组;B.模型组;C.咪唑立宾组;D.咪唑立宾+氯沙坦组;E.氯沙坦组;与正常组比较,*1P<0.05;与模型组比较,*2P<0.05Fig.2 p27m RNA expression in renal tissue on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group,*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

图3 5组大鼠第3天p27免疫荧光检测结果A.正常组;B.模型组;C.咪唑立宾组;D.咪唑立宾+氯沙坦组;E.氯沙坦组;与正常组比较,*1P<0.05;与模型组比较,*2P<0.05Fig.3 p27mRNA expression on the third day in five groups of rats by immunofluorescence detectionA.normal group;B.model group;C.m izoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

本研究发现正常组大鼠系膜细胞几乎没有增殖,模型组大鼠系膜细胞大量增殖,而给予咪唑立宾和氯沙坦治疗后,系膜细胞轻度增殖或不增殖。且咪唑立宾及联合用药的作用优于单独应用氯沙坦。咪唑立宾单独用药与联合用药之间差异无统计学意义。提示咪唑立宾能够抑制系膜细胞增殖,并且作用优于氯沙坦。该实验从体内证实了咪唑立宾具有抑制系膜细胞增殖的作用,这一结论与体外研究结论一致［5］。咪唑立宾单独用药与联合用药之间差异无统计学意义,其原因可能是咪唑立宾通过多种途径抑制系膜细胞增殖,而氯沙坦可能仅仅从影响血流动力学途径起作用［8］,具体机制有待进一步研究。

p27为细胞周期调控蛋白中最重要负性调控蛋白,可抑制大多数细胞周期蛋白-周期依赖性蛋白激酶(cyclin-CDK)复合物的激酶活性,对G1期的早期与晚期、S期等各期都有重要作用。许多研究表明p27可抑制系膜细胞增殖［9-10］。大鼠Thy1肾炎中p27与系膜细胞的增生程度呈负相关,早期p27明显下降,至系膜细胞增生最甚的第5天几乎不能测及,随后在系膜细胞停止增殖的恢复期p27水平回复到基础值,表明p27的下降可使细胞周期从G1期进展到S期,从而产生细胞增殖。CHIARA等［9］研究发现霉酚酸酯通过上调p27蛋白的表达抑制Thy1肾炎大鼠模型系膜细胞增殖。因此,将p27作为研究靶点很可能对系膜增殖性肾炎的治疗有重要的意义。

本研究发现正常组大鼠p27蛋白表达处于平台期,模型组p27的蛋白表达水平明显减少。而给予咪唑立宾及氯沙坦治疗后,治疗组大鼠p27mRNA水平无明显变化,p27的蛋白表达水平显著增加,提示咪唑立宾能够上调p27蛋白的表达,且咪唑立宾及联合用药的作用显著优于单独应用氯沙坦的作用,但联合用药的作用与单独应用咪唑立宾的作用差异无统计学意义。上述结果还提示氯沙坦也能够上调p27蛋白的表达抑制系膜细胞增殖。至于咪唑立宾的作用比氯沙坦的作用更强,其机制有待进一步研究。

本研究表明咪唑立宾能够通过上调p27蛋白表达抑制系膜细胞增殖,为咪唑立宾应用于临床治疗系膜增殖性肾小球肾炎提供重要的理论依据,为临床治疗系膜增殖性肾小球肾炎提供新的治疗靶点。

［1］YOKOTA S.Mizoribine:mode of action and effects in clinical use[J].Pediatr Int,2002,44(2):196-198.

［2］秦福芳,闫磊,方歧莹,等.咪唑立宾对大鼠急性Thy1肾炎肾小球系膜细胞增殖的抑制作用[J].中华实用诊断与治疗杂志,2011,25(12):1185-1187.

［3］章道恒,李富荣,齐晖,等.细胞周期调节负控蛋白p27在肾小球系膜细胞增殖中的调控作用[J].中国现代医学杂志,2004,14(10):98-101.

［4］王海燕.肾脏病学[M].3版.北京:人民卫生出版社, 2008:610.

［5］LIU S,XIE Y,LV Y,et al.A novel target of mizoribine inhibiting mesangial cell proliferation:S phase kinaseassociated protein 2[J].Am JNephrol,2010,32(5):447-455.

［6］SHANKLAND S J,WOLF G.Cell cycle regulatory proteinsin renal disease:role in hypertrophy,proliferation and apoptosis[J].Am JPhysiol,2000,278(4):515-529.

［7］GRIFFIN SV,PICHLER R,DITTRICH M,et al.Cell cycle control in glomerular disease[J].Springer Semin Immunopathol,2003,24(4):441-457.

［8］JIAO S,ZHENG X,YANG X,et al.Losartan inhibits STAT1 activation and protects human glomerular mesangial cells from angiotensinⅡinduced premature[J].Can J Physiol Pharmacol,2012,90(1):89-98.

［9］CHIARA M,MENEGATTIE,DISIMONE D,et al.Mycophenolate mofetil and roscovitine decrease cyclin expression and increase p27(kip1)expression in anti Thy1mesangial proliferative nephritis[J].Clin Exp Immunol,2005,139 (2):225-235.

［10］IANCU-RUBIN C,ATWEH G F.p27(Kip1)and stathmin share the stage for the first time[J].Trends Cell Biol, 2005,15(7):346-348.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.004

Effect of Mizoribine on p27 of Mesangial Cells in Rats with Acute Thy1 Nephritis

QIN Fu-fang1,SUN Qian1,SHAO Feng-min2
(1.Special Wards,People′s Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450003,China;2.Department of Nephrology,Henan Provincial People′s Hospital,Zhengzhou 450003,China)

Objective To study the effect of mizoribine(MZ)on p27 of mesangial cells in rats with acute Thy1 nephritis.MethodsNinety male rats were random ly divided into five groups,which were normal,nephritic,mizoribine treated,losartan treated,bothmizoribine and losartan treated groups.Each group had 20 ratsexcept for normal group,which had ten rats.The nephritismodel was induced and renal tissue was removed 1,3,5,7 days aftermodel was established.Mesangial cells proliferation was determined by PAS staining.The expression of p27mRNA was detected by RT-PCR,and the protein expression was tested by western blotting.ResultsCompared with the control,themesangial cells proliferation in the nephritis model group was remarkably increased,but the expression of p27 protein was decreased significantly(P<0.05).Compared with the nephritis models,treatment with MZ,losartan or MZ p lus losartan showed an obvious inhibition of the mesangial cells proliferation(P<0.05),but significantly up-regulated expression of p27 protein(P<0.05),especially with the treatment of mizoribine,and losartan plus mizoribine.(P<0.05).ConclusionBoth mizoribine and losartan can inhibit mesangial proliferation in Thy1 nephritis,and the effect ofmizoribine ismore remarkable by up-regulation of the expression of p27 protein.

Mizoribine;Thy1 nephritis;Mesangial cell;p27

R979.5;R965

A

1004-0781(2014)01-0013-04

2012-11-23

2013-05-07

*河南省科技攻关基金资助项目(112102310127)

秦福芳(1974-),女,河南新乡人,主治医师,硕士,研究方向:慢性肾小球肾炎的发病机制。电话：0371-67077327,E-mail：qinfufang1781@126.com。