水貂肺炎双球菌的分离与鉴定

秦绪伟 禚宝山 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

水貂肺炎双球菌的分离与鉴定

秦绪伟 禚宝山 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

本试验从诸城一水貂厂发病水貂分离到一株细菌，经解剖、细菌分离、镜检、生化试验确诊为肺炎双球菌，经药敏试验采取综合治疗方案，最终控制了病情。

水貂 双球菌 肺炎 鉴定

肺炎球菌又称肺炎双球菌，属于革兰氏阳性球菌中链球菌属[1]，在自然界中分布广泛，可引起各种动物的大叶性肺炎或者脑膜炎，亦可致幼兽肺炎或者败血症[2]。临床上很少会见到急性发病案例，多种健康动物的呼吸道可以分离到肺炎双球菌，一般不作为致病菌，只有条件恶劣机体抵抗力差的时候才会发病。此次水貂养殖场发生急性死亡、口鼻流血的病例，经诊断确诊为肺炎双球菌病。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 来自于山东诸城一水貂养殖场，养殖水貂3000只，咳嗽、口鼻出血，发病水貂经解剖无菌条件分离肺脏、气管，获得一株细菌。

1.1.2 其他材料 营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂等购自青岛海博生物技术有限公司；微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；其他实验室常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养与镜检 无菌条件下取水貂的肺脏，切开后在血清营养琼脂涂抹，37℃恒温培养箱培养24h，将分离菌接种于血清营养琼脂、鲜血平板、麦康凯琼脂、SS琼脂，37℃恒温培养箱培养24h观察生长情况。取血清平板上典型的菌落，进行革兰氏染色，油镜镜检。

1.2.2 细菌的生化试验 将分离菌接种于加血清的马丁肉汤培养基37℃恒温摇床震荡培养24h，取培养液0.2ml接种于乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖、梨醇、甘露醇、触酶试验、七叶苷、胆盐等微量生化反应管，培养24h记录各种生化管的反应情况。

1.2.3 细菌的分子生物学鉴定 16S rRNA：无菌挑取平板上的菌落加入到1ml无菌水中，震荡混匀后沸水浴7min，冰浴5min，离心上清作为基因扩增的模板，设计引物：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’，PCR反应体系(50ul)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500 mmol/L)5ul，2.5mmol/L dNTP 4ul,引物(20umol/L)各1ul，模板2ul，ddH2O36.8ul，Taq酶(5U/ul)0.25ul。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min。取PCR产物5ul用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送交上海基因测序公司进行测序，将测序结果提交Genbank进行比对，构建系统发育树，判定细菌的系统发育地位，以97%相似性为界限判定为何种菌。

1.2.4 细菌的药敏试验 无菌取血清平板上的典型菌落，在平板上均匀涂抹，将标准化的药敏片贴在平板上，37℃恒温培养箱培养24h，使用直尺测量抑菌圈的直径，观察细菌对各种药敏片的敏感程度。

1.2.5 细菌的毒力试验 在无菌条件下使用接种环挑取单个菌落，接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温摇床震荡培养24h，100倍稀释后腹腔注射小白鼠，0.3ml/只共计5只，连对照组2只一起饲养，注射后观察7日。

2 结果与分析

2.1 细菌培养与镜检结果

分离菌在血清平板上生长为密集的细小的露珠样透明菌落，鲜血平板可见灰白色细小菌落呈现明显的溶血环，麦康凯琼脂、SS琼脂不生长。在显微镜下可见细菌较纯，呈现革兰氏阳性球菌，细菌呈矛头状，多两两成对，也有的连接成4个或者双排。

2.2 细菌的生化结果

取0.2ml细菌液体培养液接种于微量生化反应管，可见细菌分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖，不分解山梨醇、甘露醇，触酶试验阴性，七叶苷阳性，胆盐溶解阳性。具体结果见表1。

表1 分离菌生化鉴定结果

2.3 细菌的分子生物学鉴定结果

根据上海测序公司的测序结果，采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行校对，然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，最后利用构建系统发育树，与肺炎链球菌相似性为99.9%，最终确定为肺炎链球菌。

2.4 细菌的药敏试验结果

使用药敏纸片法测量分离菌对各种药物的敏感性，可见头孢喹肟、头孢哌酮、头孢噻呋、阿莫西林、青霉素高敏，万古霉素、强力霉素、阿米卡星、安普霉素、替米考星中度敏感，左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考低度敏感，林可霉素、复方新诺明、粘杆菌素不敏感。具体药敏结果见表2。

表2 分离菌的药敏直径 (mm)

2.5 毒力试验结果

100倍稀释后的细菌培养液注射5只小白鼠第3天全部死亡，对照组观察7日，全部健活。死亡小白鼠心血分离到革兰氏阳性双球菌。该双球菌有较强的毒力。

3 讨论

3.1 肺炎双球菌的分离鉴定

此次水貂发病为激素水貂，天气比较热，正值换毛期间，换毛引起的机体抵抗力差，呼吸道的正常菌群大量繁殖成为致病菌，造成了大量的死亡，主要症状急性死亡、死亡水貂营养状况良好、口鼻有的出血，解剖可见肺部严重出血肿大、气管环内大量血沫，之前按照绿脓杆菌引起的出血性肺炎投服氟苯尼考3d未见明显改善。

3.2 肺炎双球菌的症状

水貂感染肺炎双球菌主要症状为大群精神、食欲正常，发病的水貂急性死亡，有的几分钟，有的几个小时，突然发病，有的突然尖叫口鼻流血死亡，病程长的可见精神沉郁、不吃食，逐渐后肢瘫痪、弓背、呻吟，步态蹒跚或者地上打滚，最后呼吸急促，全身瘫软死亡。剖检可见肺脏肿大出血呈现黑色，气管内有大量的血液或者血样泡沫，有的肝脏、肾脏出血。

3.3 肺炎双球菌的诊断

多种细菌都可以感染水貂引起肺炎，呈现比较严重的急性死亡、口鼻流血、肺脏肿大出血的比较常见的是绿脓杆菌，另外还有巴氏杆菌、克雷伯氏菌、侵肺型大肠杆菌、肺炎双球菌等，这几种细菌引起症状基本相同，但是治疗和传染性不同，因此需要细菌分离鉴别诊断。肺炎双球菌在显微镜下直接涂片镜检见革兰氏阳性双球菌即可诊断，其他细菌镜检都为阴性，及时诊断有助于选择对症的药物，及时控制疾病。绿脓杆菌细菌分离可见平板绿色菌落，大肠杆菌在麦康凯培养基呈现红色，巴氏杆菌在镜检下可见两极浓染的小杆菌、麦康凯和SS培养基不生长，克雷伯氏菌呈现粘稠的拉丝菌落，这些特征在实验室条件下通过简单的检测都可以区别于肺炎双球菌。

3.4 肺炎双球菌的防制

肺炎双球菌现在没有有效的疫苗进行防疫，只能从饲料、环境卫生方面进行控制，不要饲喂变质的饲料，疑似变质饲料全部熟制，发病后及时诊断，及时采用敏感性高的药物进行治疗。本次病例，发病后每天使用聚维酮碘全群带动物消毒，饲料全部熟制，第2天开始投服敏感药物阿莫西林，发病严重的注射头孢噻呋，第3天死亡减少，第5天停止死亡，有效的控制了疫情。

[1] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解第2版[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2006, 97-98.

[2] 陆承平. 兽医微生物学第5版[M]. 北京: 中国农业出版社, 2013, 83-90.

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