刀豆蛋白A诱导人脐静脉内皮细胞表达p-ERK1/2

龚文广，王红梅，牛青霞

(汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所及病理生理学教研室，广东 汕头 515041)

刀豆蛋白A诱导人脐静脉内皮细胞表达p-ERK1/2

龚文广，王红梅，牛青霞

(汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所及病理生理学教研室，广东 汕头 515041)

目的探讨刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)对CRL2480细胞(人脐静脉内皮细胞系)细胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2磷酸化的影响。方法采用MTT法检测ConA对CRL2480细胞活化的影响；采用Western印迹法检测CRL2480细胞磷酸化(p)-ERK1/2的表达；采用细胞免疫荧光技术检测p-ERK1/2在细胞内的分布。结果在5～20 μg/ml范围，ConA刺激CRL2480细胞8 h的活化指数具有剂量依赖性；20 μg/ml ConA显著增加CRL2480细胞的活化(P＜0.05)。ConA能够增加CRL2480细胞的p-ERK1/2表达水平(P＜0.05)，ERK途径抑制剂PD98059和U0126明显抑制p-ERK1/2表达。免疫荧光染色结果显示ConA刺激细胞的荧光信号明显高于对照细胞，荧光分布于细胞浆、细胞核周围和细胞核内。结论ConA能够激活CRL2480细胞表达p-ERK1/2。

刀豆球蛋白A；内皮细胞；细胞外调节蛋白激酶

刀豆蛋白A又称伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A，ConA)，是从巨刀豆中提取的一种植物凝集素，为四聚体蛋白，可以与生物大分子末端的α-D-甘露糖基以及α-D-葡萄糖基结合[1]。因小鼠模型中，ConA肝损伤的某些病理变化类同与人肝炎的病理特点，据此ConA肝损伤常被用于研究人的肝脏疾病[2]。尾静脉注射的ConA主要结合于肝内皮细胞[3]。另外，ConA与肿瘤免疫细胞的激活和肿瘤新生血管密切相关[1]，被视为新的抗肿瘤策略。血管内皮细胞位于血管的内表面，不断受到血源性因素刺激，积极参与炎症、凝血和血管新生等病理生理过程。因此，我们认为血管内皮细胞在ConA相关的反应中起重要作用。细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated proteinkinases，ERK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Serine/ threonine，Ser/Thr)蛋白激酶，包括ERK1和ERK2(统称为ERK1/2)。ERK1/2信号途径属于丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族，能够被生长因子、细胞因子、丝裂原等诸多因素激活，调节细胞功能(如增殖、迁移和表达炎症介质)，与炎症、肿瘤及血管性疾病密切相关[4-5]。本研究采用CRL2480细胞(人脐静脉内皮细胞系)为细胞研究模型，观察ConA及ERK信号途径抑制剂(PD98059和U0126)对磷酸化(p)-ERK1/2分子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料、仪器和培养液 CRL2480细胞系购自ADCC(美国)；胎牛血清(FBS)、胰胰岛素-转铁蛋白-硒添加物(ITS)、M199培养液、谷氨酰胺和抗小鼠Cy3荧光抗体购自Invitrogen公司(美国)，内皮细胞生长添加物(ECGS)购自EMD Bio-sciences公司(美国)；肝素、ConA、青霉素-链霉素、噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司美国)；ERK信号CASE试剂盒(包括抗 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、抗-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)、二抗及各种缓冲液)购自SuperArray公司(美国)；PD98059和U0126购自Calbiochem公司(美国)；抗β微管蛋白抗体购自CST公司(美国)；细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所(中国)，丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺混合物(1:29)购自Bio-Rad公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国)。主要仪器包括倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)、CO2培养箱(Kendro公司，德国)、生物安全柜购自(Heal force公司，中国)、离心机(Eppendorf公司，美国)、电泳仪和半干转膜仪(Bio-Rad公司，美国)、扫描仪(Amersham公司，美国)和酶标仪(Molecular Devices公司，美国)。完全培养液包括12.5 μg/ml ECGS，100 μg/ml肝素、10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L Hepes和M199培养液，无血清培养液包括不含血清的完全培养液和1%ITS，12.5%聚丙烯酰胺凝胶、凝胶电泳及转膜缓冲液按分子克隆实验指南[6]配制。

1.2 细胞培养 CRL2480细胞培养于完全培养液中，密度约90%时，胰蛋白酶消化、传代，3～4 d传代1次。

1.3 MTT法检测CRL2480细胞活性 将CRL2480细胞接种于96孔培养板，密度约80%。将完全培养液换为无血清培养液，培养过夜。分别用5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml ConA刺激细胞30 min和8 h。加2.5 mg/ml MTT，20 μl/孔，继续培养4 h。吸弃培养上清，加二甲亚砜150 μl/孔，570 nm波长下检测吸光度值。复孔6个，实验重复4次。细胞活化指数= ConA刺激细胞的A570值/对照细胞的A570值。

1.4 Western印迹法检测p-ERK ①样品制备：完全培养液培养细胞至密度为80%，换为无血清培养液，过夜。PD98059和U0126预处理细胞30 min，20 μg/ml ConA刺激细胞15 min，对照细胞组不加ConA。吸弃培养液，加入裂解液，冰上裂解30 min，收集细胞裂解液。4℃下，离心8 000 r/min×15 min，收集上清。②12.5%SDS-PAGE分离蛋白：按分子克隆实验指南操作[6]。煮沸样品5 min，20 μl/孔。80 V 1 h，100 V 2 h。③半干转膜仪转移蛋白：20%甲醇缓冲液作用PVDF膜10 min。在半干转膜仪板上，依次放置滤纸、电泳后凝胶、甲醇处理的PVDF膜和滤纸，加盖。15 V 1 h。④处理含目的蛋白的PVDF膜：封闭缓冲液封闭PVDF膜1 h，洗涤缓冲液洗膜3次，5 min/次。分别加抗p-ERK1/2和抗-ERK1/2抗体(1:1 000)，4℃孵育过夜，洗膜3次。加二抗(1:100)，1 h/室温，洗膜3次。⑤结果视化和半定量处理：按试剂说明书，加发光液，曝光、显影、定影、扫描，ImageJ软件半定量分析显色条带。⑥PD98059和U0126浓度选择：0 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L PD98059，0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L U0126、ConA对照以及溶剂(二甲亚砜)对照预处理CRL2480细胞30 min，20 μg/ml ConA刺激细胞15 min，进行预试验，因50 μmol/L PD98059和10 μmol/L U0126几乎完全抑制ConA诱导的p-ERK1/2表达。因此，将他们用于本研究。

1.5 细胞免疫荧光法检测 p-ERK1/2 将CRL2480细胞接种于培养孔中，完全培养液培养24 h，无血清培养液培养过夜。50 μmol/L PD98059和10μmol/LU0126预处理细胞30 min后，20μg/ml ConA处理细胞15 min，PBS洗细胞3次。固定、通透、洗细胞，封闭缓冲液封闭非特异性位点1 h。加抗p-ERK1/2抗体，4℃孵育过夜。洗细胞，加cy3标记的抗小鼠荧光二抗结合物(1:800)，室温避光孵育30 min，洗细胞。Hochest3342(1:3 000)染细胞核，洗细胞，荧光显微镜下观察、拍照。

2 结 果

2.1 ConA对CRL2480细胞活化的影响 MTT法检测表明：在5～20 μg/ml范围内，ConA处理8 h，CRL2480细胞的活化具有剂量依赖性；20 μg/ml ConA显著增加CRL2480细胞的活化指数(P＜0.05)。因此，20 μg/ml ConA被用于进一步研究。ConA处理细胞30 min，各剂量组间活化指数的差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1 ConA对CRL2480细胞活化指数的影响(n=4)

2.2 PD98059和U0126对CRL2480细胞活化的影响 ConA处理CRL2480细胞8 h的MTT结果表明：①ConA处理细胞的活化指数高于对照细胞(P＜0.05)；②50 μmol/L PD98059和10 μmol/L U0126组的活化指数与细胞对照组的差异无统计学意义(P＞0.05)：③50 μmol/L PD98059+ConA和10 μmol/L U0126+ConA组细胞的活化指数低于ConA组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。ConA处理CRL2480细胞30 min，各观察组间活化指数的差异无统计学意义(P＞0.05)。这提示MTT法的灵敏度不足以反映PD98059和U0126对ConA作用的抑制效应。

2.3 ConA诱导p-ERK表达 Western印迹法结果表明：20 μg/ml的ConA刺激CRL2480细胞15 min，p-ERK1/2表达水平明显高于对照细胞(P＜0.05)；50 μ mol/L PD98059和10 μmol/L U0126显著抑制ConA诱导的p-ERK1/2表达水平(P均＜0.05，图2A，2B)。免疫荧光染色显示：ConA处理细胞的荧光信号明显高于对照细胞；荧光斑点分布于细胞浆、细胞核周围和细胞核内；PD98059和U0126预处理细胞的荧光信号明显减弱(图2C)。

图2 ConA对p-ERK1/2表达的影响(n=4)

3 讨论

采用蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)野生型和突变型成纤维细胞，研究信号转导时发现：通过SHP2-ras-ERK和SHP2-ras-p38途径，ConA刺激细胞基质金属蛋白酶-2分泌[7]；ConA通过SHP2-MEK1-ERK途径，ConA促进细胞分泌金属蛋白酶组织抑制剂-2[8]。Zhao等[9]在细胞表面糖蛋白PZR的研究中发现：ConA刺激HT-1080，293和HeLa细胞，可以引起细胞表面PZR酪氨酸磷酸化，激活SHP2和细胞凝集反应。Roy等[9]报道ConA通过MEK/ERK途径，激活HeLa细胞的自噬作用。我们用ConA处理CRL24808细胞8 h，该细胞活化水平升高。Western印迹法结果表明ConA能够增加CRL2480细胞的p-ERK1/2分子表达。采用抗p-ERK1/2抗体染色的结果显示：ConA处理细胞的荧光强度显著高于对照细胞；荧光分布于细胞浆、细胞核周围及细胞核内；ERK途径抑制剂PD98059和U0126显著降低ConA诱导的p-ERK1/2水平。这表明ConA能够激活CRL2480细胞的ERK信号途径。当用ConA和层粘连蛋白刺激小鼠腹水肝癌细胞，可以引起微丝在细胞膜下重新组装，并且促进DNA合成，提示微丝在信号分子从细胞膜运输到细胞核中起关键作用[11]。胡良高等[12]研究表明ConA与巨噬细胞膜受体结合后，加速膜下肌动蛋白多聚化，微丝走向从细胞膜延伸到细胞中央。本研究中：内皮细胞浆内的红色丝状荧光物质，可能与p-ERK1/2附着在微丝上面有关；细胞核周围的荧光信号可能与细胞浆p-ERK1/2向细胞核内移动、聚集有关。据此，我们认为ConA能够通过内皮细胞膜表面的结合位点，引起细胞浆的p-ERK1/2分子表达升高。p-ERK1/2进入细胞核，启动转录、mRNA和蛋白质的表达(图3)。

图3 ConA激活CRLl2480细胞ERK信号途径模式图

综上所述，ConA能够激活CRL2480细胞表达p-ERK1/2，提示干预ERK的活化有利于调节内皮细胞和血管的功能。

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Concanavalin A enhances p-ERK1/2 expression in CRL2480 cells.

GONG Wen-guang,WANG Hong-mei,NIU Qing-xia.

Institute of Inflammation and Immune Disease,Department of Pathophysiology,Medical College of Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the influence of concanavalinA(ConA)on the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase(p-ERK)1/2 in CRL2480 cells(human umbilical vein endothelial cell line).MethodsActivated effect of ConAon CRL2480 endothelial cells was detected by MTT assay.P-ERK1/2 expression was examined by western blot.The distribution of p-ERK1/2 was observed via immunofluorescent staining.ResultsAfter 8h incubation,ConA increased the activated index of the cells in a dose dependent manner in the range of 5～20 μg/ml(P＜0.05).The immunoblot displayed that 20 μ g/ml ConA increased p-ERK1/2 expression in the cells(P＜0.05).PD98059 and U0126(both ERK pathway inhibitors)exerted inhibitory action on p-ERK1/2 expression(P＜0.05).The fluorescent intensities existed in the cytoplasm and the nuclei of ConA-treated cells were much stronger than those of control cells.Conclusion ConAis able to upregulate p-ERK1/2 expression in CRL2480 cells.

ConcanavalinA;Endothelial Cells;Extracellular signal-regulated kinase

R329.2+8

A

1003—6350（2014）14—2029—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.14.0790

2014-01-24)

国家自然科学基金(编号：81072941)

牛青霞。E-mail：gongwenguang@163.com