肠源性高草酸尿大鼠模型的建立

陈清江，李 逊，雷 鸣，何永忠

(1.广州医科大学附属第五医院泌尿外科，广东 广州 510700；2.广州医科大学附属第一医院海印微创外科中心，广东 广州 510120)

肠源性高草酸尿大鼠模型的建立

陈清江1，李 逊1，雷 鸣2，何永忠1

(1.广州医科大学附属第五医院泌尿外科，广东 广州 510700；2.广州医科大学附属第一医院海印微创外科中心，广东 广州 510120)

目的建立肠源性高草酸尿的大鼠模型。方法随机选取30只雌性SD大鼠置于大鼠代谢笼中适应性喂养7 d之后收集24 h尿，记录尿量，采用离子色谱仪测定其草酸浓度，计算正常大鼠在该条件下24 h尿草酸排泄量。菠菜汁灌胃处理大鼠，再测定灌胃后24 h尿草酸排泄量。对比灌胃菠菜汁前后，大鼠24 h尿草酸排泄量的差别；分组对照实验，随机选取20只雌性SD大鼠，随机分成A组和B组，B组灌胃菠菜汁，A组灌胃等量纯净水，其他条件相同，比较两组24 h尿草酸排泄量。结果反复测定，正常大鼠灌胃菠菜汁前24 h尿草酸排泄量为(0.53±0.18)mg，灌胃菠菜汁后第1天为(1.93±0.36)mg，第3天为(1.85±0.38)mg，第7天为(2.03±0.39)mg；A组(0.44±0.12)mg，B组(1.68±0.38)mg。结论大鼠在灌胃菠菜汁之后其尿液24 h草酸排泄量明显增加，大概增加3～4倍，说明每天对大鼠进行定量定浓度的菠菜汁灌胃，可以使其保持长期的高草酸尿状态，该方法建立的肠源性高草酸尿大鼠模型简便可行，可广泛用于其他方面的研究。

肠源性高草酸尿；尿；大鼠模型；离子相色谱

我国泌尿系结石的人群患病率为2%～5%[1]。泌尿系结石是泌尿外科的常见病多发病，因此，如何预防泌尿系结石已日益成为人们关心的问题。我国是世界上泌尿系结石三大高发区之一，大部分尿路结石为草酸钙结石，而高草酸尿是其重要的成石因素。本实验拟从大鼠日常饮食中添加外源性高草酸食物(菠菜)，构建肠源性高草酸尿症的动物模型，旨在探讨通过饮食控制能否控制尿液草酸浓度，降低尿路结石成石因素，从而起到预防尿路结石的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 菠菜购自超市，自然完整状态下洗净晾干，用水果榨汁机榨成菠菜汁，密封保存于4℃。

1.2 仪器和试剂 实验仪器：离子色谱仪792 Basic IC(瑞士万通公司)，其操作方式通过792 BasicIC 1.0软件控制和估算。大鼠代谢笼(广州飞迪科技有限公司)。试剂配制：淋洗液：分别称取5.007 4 g的Na2CO3和0.294 0 g的NaHCO3加去离子水至2 L，配制成浓度为17.5 mmol/L的Na2CO3和3.5 mmol/L的NaHCO3；再生液：4 ml浓H2SO4加去离子水配制成浓度为50 mmol/L。取二水草酸(C2H2O4·2H2O)0.143 2 g加去离子水100 ml配制成浓度为1 mg/ml的标准储备液，可4℃保存1周，再配制100 mg/L的工作液。

1.3 实验动物 50只SD大鼠(雌性，SPF级)，体重在200～220 g，购于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2008-0002]。

1.4 实验方法

1.4.1 自身灌胃前后对照 随机选取30只SD大鼠置于大鼠代谢笼中，标准颗粒饲料喂养，自由饮用自来水，适应性喂养7 d之后收集第1天的24 h尿，记录尿量，取0.1 ml尿液，用去离子水滴定至5 ml，再通过0.2 μm的微孔滤膜过滤后注入离子色谱仪，检测尿中草酸浓度，计算大鼠24 h尿草酸排泄量；同法计算第3 d大鼠24 h尿草酸排泄量，统计出正常大鼠24 h尿草酸排泄量；实验过程中若有大鼠日饮水量低于10 ml，收集尿液低于4 ml，则将其从实验中剔除。

1.4.2 菠菜汁灌胃前后对照 市场购入新鲜菠菜，洗净晾干，采用水果榨汁机将其榨成菠菜汁，取菠菜汁0.1 ml加入去离子水稀释至5 ml，通过0.2 μm的微孔滤膜后注入离子色谱仪，计算菠菜汁浓度，大概5～6 mg/ml，以100 mg/(kg·d)的菠菜汁草酸浓度对实验大鼠进行灌胃处理。分别于灌胃第1、3、7天收集大鼠24 h尿，同法检测24 h尿液草酸排泄量。与灌胃前的24 h尿草酸排泄量形成比较。

1.4.3 随机分组对照 随机选取20只SD大鼠，随机分为A组和B组，每组10只，B组按之前的方法灌胃菠菜汁，A组灌胃等量的纯净水，置于代谢笼中收集24 h尿液，计算尿量，离子色谱仪检测尿液草酸浓度，其他实验条件一致。每次收集24 h尿的前一天记录大鼠的体重(g)。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0进行统计学分析，数据采用均数±标准差()表示。组间均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 草酸标准曲线的绘制 取100 mg/L的工作液，用去离子水稀释至1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，分别注入离子色谱仪进样孔，在6.18 min出现草酸峰，经过792 Basic IC 1.0软件进行数据处理，自行绘制标准曲线。草酸在1～20 mg/L范围内，线性关系良好，RSD=1.106%，曲线相关系数r=0.999 91，偏移值(截距)为0.685 33，斜率为2.711 43，回归直线方程Y=2.711 43X+0.685 33，灵敏度达0.04 mg/ml，同时取工作液，分别稀释至0.25 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L，发现其在0～1 mg/L范围内也有良好的线性关系。草酸回收实验结果见表1。

表1 草酸回收实验结果

2.2 大鼠体重 实验各组大鼠的体重均逐渐增加，灌胃前与灌胃后1 d分组对照实验组间差异无统计学意义(P＞0.05)

2.3 大鼠24 h尿量 无论是自身对照还是分组对照实验，各组间差异无统计学意义(P＞0.05)

2.4 24 h尿草酸排泄量 灌胃后各组与灌胃前比较，24 h尿草酸排泄量明显增加，但灌胃后三组之间差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2、表3。

注：与灌胃前比较，aP＜0.05。

表3 分组对照实验24 h尿草酸排泄量的比较()

表3 分组对照实验24 h尿草酸排泄量的比较()

注：B组与A组比较，P＜0.05，大概升高3～4倍。

组别A组(n=10) B组(n=10)尿草酸排泄量(mg/24 h，) 0.44±0.12 1.68±0.38

3 讨 论

在临床上，尿路结石成分分析显示出82%左右是草酸钙结石[2]，在草酸钙结石的成石因素中，尿液中高草酸这一因素占据着主导地位，肾小管上皮细胞损伤是结石形成的必备条件，而尿液高草酸浓度能对肾小管上皮细胞产生细胞毒作用，通过抗氧化自由基作用而损伤肾小管上皮细胞，促进结晶的粘附[3-4]。高草酸尿症在临床上分为：特发性高草酸尿、肠源性高草酸尿和原发性高草酸尿。原发性高草酸尿是由于肝脏缺乏AGT和DGDH或者功能异常导致的，特发性高草酸尿表现出一定的家族遗传性，可由具有明显高草酸尿症的近交系大鼠传代培养获得[5]，而肠源性高草酸尿症则有慢性肠病、短肠综合征等病因诱发，想要获取其动物模型较难。本实验基于在饮食中添加外源性草酸，使其肠内游离草酸增多，进而增加了外源性草酸的吸收，最终增加了尿草酸的排泄量[6-7]，从而获得高草酸尿症的动物模型。本文重点在于研究泌尿系结石的成石因素，研究表明，高草酸尿是草酸钙结石最危险的成石因素，高草酸尿对草酸钙过饱和的影响是其他影响因素的10倍[8]；本实验选取菠菜作为外源性高草酸的饮食来源，因其作为人们喜爱的蔬菜，一直以营养价值高而备受欢迎，此外其获取途径简便快捷、经济易操作，同时菠菜是一种大家熟悉的富含草酸的食物，高草酸对于人体来说是一种抗营养因子，长期食用可增加尿液草酸排泄量，引起泌尿系结石[9-11]，是否增加饮食中草酸的含量，就会增加尿液草酸的排泄量？是否稳定？这些就是本实验所要解决的问题。

实验中采取饮食中添加菠菜的方法，来达到高草酸尿症的效果。菠菜取材简便，草酸含量高，是人们日常饮食中较为常见的蔬菜，也广为大众喜爱，以该方法构建高草酸尿症的动物模型，是本实验的创新点之一。由于以前缺乏精确检测草酸的方法和仪器，难以对尿液草酸，食物中草酸的含量进行检测，也就难以从这些方面构建高草酸尿症的动物模型。然而本实验采用离子色谱法[12]检测草酸含量，可以解决这个问题，其精度可以达到0.5 μm/L，操作过程简便，快捷，样本处理简单，适用于大规模检测草酸，能满足该实验大规模筛选测定草酸含量的需要，是一种先进的检测技术。该方法具有方便快捷、操作简便、所需尿量少、结果准确等优点。而本实验中的标准曲线、重复性实验、回收率实验等也证实了这一点。传统的变色酸比色法检测尿液草酸需要水浴浓硫酸，对工作人员和环境有影响，且实验时间长，草酸需要1～2 d，难以满足大规模样本的测定，而本实验的离子色谱法，测定一个样本的时间只需要6～8 min。

先进的大鼠代谢笼，其设计特点使得大鼠的尿液和粪便得以分离，在经过实验方法改良之后，能完全将尿液和粪便隔离，从而保证能够准确的收集到大鼠24 h尿液且无粪便污染，这些设计得以保证大鼠24 h尿液草酸排泄量测定的可靠性。

大鼠饮食中，对标准颗粒饲料所含的草酸进行检测，使得颗粒饲料中的草酸含量稳定，从而保证其测定结果具有可比性。控制单一变量，添加菠菜汁与否。在以上的条件下进行试验，其结果不添加菠菜饮食的大鼠24 h尿草酸为(0.53±0.18)mg，添加菠菜饮食的大鼠24 h尿草酸为(1.85±0.38)mg。饮食中添加菠菜的大鼠中尿草酸比不添加菠菜的大鼠要高出3～4倍，且进行持续性的灌胃菠菜汁处理，观察7 d、1个月，其尿液草酸含量基本稳定在一个较高的范围内(1.35～2.68)mg/24 h。如果停止灌胃菠菜汁，一般于第三天其尿草酸可以降到正常范围。提示该肠源性高草酸尿的大鼠模型需要持续性给予高草酸饮食才能达到维持建模效果。由于菠菜汁获取途径简便，灌胃操作简单，本肠源性高草酸尿的大鼠模型的构建还是很成功的，可以广泛用于其他方面的研究，提供动物模型。本动物模型的构建成功，也为后续比较乳双歧杆菌和产甲酸草酸杆菌降低尿草酸能力的比较提供可靠的动物模型。

本实验成功构建了大鼠的肠源性高草酸尿症动物模型，验证了饮食中如果长期高草酸饮食可以引起尿草酸增加的现象，从而指导日常饮食，但长期的尿液高草酸状态是否就会引起泌尿系结石仍值得进一步探讨。

综上所述，通过控制大鼠外源性草酸的摄入量，可以在大鼠体内成功建立“肠源性高草酸尿症”动物模型。结合该实验模型，针对我国素食习惯为主人群，对于预防草酸钙结石和防止结石复发起着重要的指导作用。

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Establishment of rats model with enterogenous hyperoxaluria.

CHEN Qing-jiang1,LI Xun1,LEI Ming2,HE Yong-zhong1.
1.Department of Urology Surgery,the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University, Guangzhou 510700,Ghuangdong,CHINA;2.Haiyin Minimally Invasive Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medicine University,Guangzhou 510120,Ghuangdong,CHINA

ObjectiveTo establish enterogenous hyperoxaluria model in rats.MethodsThirty randomly selected female Sprague-Daw-ley rats were fed in individual metabolic cage for 7 days.24 h urine oxalate excretions were examined by ion chromotagraphy before and after the spinach juice lavage,and the difference was investigated. Another 20 female Sprague-Daw-ley rats were randomly divided into group A and group B.Group B was lavaged with spinach juice and group A was lavaged with equivalent pure water.24 h urine oxalate excretions of group A and group B were compared.ResultsThe 24 h urine oxalate excretion was(0.53±0.18)mg before lavaging spinach juice.On first day,third day and seventh day after lavaging spinach juice,the 24 h urine oxalate excretions were(1.93±0.36)mg, (1.85±0.38)mg,and(2.03±0.39)mg，respectively.The 24 h urine oxalate excretion of group A and group B were (0.44±0.12)mg and(1.68±0.38)mg,respectively.Conclusion The 24 h urine oxalate excretion of SD rats was markedly increased 3 to 4 times after lavaged with spinach juice.Daily lavage with quantitatively and constant concentration spinach juice can maintain long-term high oxalic acid urine state in rats.This method of establishing enterogenous hyperoxaluria model in rats is simple and feasible,which can be widely used.

Enterogenous hyperoxaluria;Urine;Rats model;Ion chromotagraphy

R-332

A

1003—6350（2014）14—2036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.14.0792

2014-01-20)