绝食法与无氮饲粮法测定黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量及变异的比较研究

任立芹 赵 峰* 谭会泽 张建智 米宝民 赵江涛 张宏福

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193;2.广东温氏集团食品有限公司，新兴 527439)

目前，国际上普遍采用氨基酸真消化率或标准氨基酸消化率来表达氨基酸的生物学效价[1-3]。而氨基酸真消化率都是通过测定氨基酸的表观消化率与内源性氨基酸的排泄量后计算得出。因此，选择准确测定内源性氨基酸排泄量的方法对氨基酸真消化率的测定非常关键。在鸡饲料氨基酸生物学效价的测定中，Sibbald[4]将用于鸡饲料代谢能值测定的“排空强饲法”应用于氨基酸真消化率的测定[1]，其内源性氨基酸排泄量的测定是采用试验鸡在排空48 h基础上，通过收集与表观氨基酸消化率测定相同时间内的绝食鸡的氨基酸排泄量估测。由于内源性氨基酸的排泄量主要来源于消化液及脱落的肠壁细胞，绝食状态下内源性粪尿中氨基酸排泄量可能与采食待测饲料条件下内源性损失不同，因此，许多学者建议使用无氮饲粮(N-free diet，NFD)测定内源性氨基酸排泄量[5-6]。在绝食法与无氮饲粮法测定内源性氨基酸排泄量的差异上，Song 等[2]、黎观红等[7]、翟少伟等[8]和 Muztar等[9]研究发现，无氮饲粮条件下鸡内源性氨基酸排泄量显著高于禁食鸡。Sibbald[1]和 Likuski等[10]却发现，禁食条件下鸡内源性氨基酸排泄量与无氮饲粮条件下无显著差异。由此可见，不同研究者在这2种方法的比较上得出了不同的结论。那么，在这2种方法中哪一种方法测定的内源性氨基酸排泄量更稳定?2种方法测值的绝对差值有多少?其引起饲料氨基酸真消化率的变化程度如何?这些问题的探讨对饲料氨基酸真消化率测定中内源性氨基酸排泄量的准确测定非常重要。为此，本研究以黄羽肉鸡为试验对象，通过分析绝食和饲喂无氮饲粮条件下内源性氨基酸排泄量及其变异的情况，为鸡饲料可利用氨基酸评定中内源性氨基酸测定方法的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及管理

采用单因素完全随机设计，选择健康、体重(平均2.8 kg)基本一致的18周龄黄羽肉公鸡(广西土鸡2号)72只，随机分成3组，每组6个重复，每个重复4只鸡，分4个批次重复测定绝食、强饲25 g无氮饲粮、强饲40 g无氮饲粮条件下的内源性氨基酸排泄量。每批次代谢试验完成后，试验鸡进入14 d的恢复期。代谢试验在广东温氏食品有限公司肉鸡试验场进行，试验鸡单笼饲养于代谢笼中，饲养管理按动物营养学国家重点实验室常规程序进行。代谢室的温度维持在25℃，每日光照12 h。

1.2 试验饲粮

试验鸡恢复期试验饲粮为玉米-豆粕型商品饲粮(代谢能12.13 MJ/kg，粗蛋白质17.05%，温氏集团食品有限公司生产)，无氮饲粮由玉米淀粉(粗蛋白质0.30%)与1%预混料混合而成。玉米淀粉来源于玉米的加工产物，由秦皇岛骊骅淀粉股份有限公司生产，预混料组成同恢复期试验饲粮中预混料。

1.3 代谢试验法测定内源性氨基酸排泄量

鸡内源性氨基酸排泄量测定过程参照Sibbald[1，4]代谢试验法进行，具体过程如表 1 所示。

表1 鸡内源性氨基酸排泄量的测定程序Table1 Procedure of determining endogenous amino acid excretion in chickens

排泄物的收集技术参照GB/T 26437—2010[11]的方法进行，每次待集粪袋中的排泄物超过粪袋容积的1/4时，将排泄物无损失地转入相应编号的培养皿中，待每只试验鸡完成48 h的收集期后，将全部粪样转入65℃烘箱中鼓风干燥。烘干样在天平室回潮24 h后称重，粉碎过40目筛制成风干样品。饲料和粪样的氨基酸含量用日立L-8500A氨基酸分析仪测定，同时测定样品的干物质含量。

1.4 数据处理与统计分析

绝食法与无氮饲粮法测定黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量的变异系数按下列公式计算:

式中:Yij为第i个批次的第j个观测值;¯Yi为第i个批次的均值;¯Y为样本总均值;G为组数;N为样本总数;Ni为第i个组样本量。

数据统计分析按照单因素完全随机设计，利用SAS 9.0中的PROC ANOVA模块对绝食条件下黄羽肉鸡的内源性氨基酸排泄量、无氮饲粮条件下内源性氨基酸排泄量数据进行方差分析，其统计模型为:

式中:μ 为总平均值;αi为组间效应;εij为随机误差。平均值间差异的显著性采用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果

2.1 绝食法与无氮饲粮法测定黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量的比较

从绝食组、25 g无氮饲粮组、40 g无氮饲粮组内源性氨基酸排泄量的变异看(表2)，3个组17种内源性氨基酸排泄量平均变异系数分别为13.5%、21.4%、22.2%，绝食组内源性氨基酸排泄量的平均变异系数低于无氮饲粮组。在总氨基酸(17种)的排泄量上，绝食组、25 g无氮饲粮组、40 g无氮饲粮组内源性氨基酸排泄量依次显著增加(P＜0.05)，其中25 g无氮饲粮组的总氨基酸排泄量为绝食组的1.32倍，40 g无氮饲粮组的总氨基酸排泄量为绝食组的1.58倍。17种氨基酸中有8种氨基酸(苏氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸)的内源性排泄量在强饲40 g无氮饲粮、强饲25 g无氮饲粮和绝食条件下依次显著降低(P＜0.05)，6种氨基酸(蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的内源性排泄量在强饲25和40 g无氮饲粮条件下差异不显著(P＞0.05)，但都显著高于绝食条件下的相应值(P＜0.05);3种氨基酸(胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸)的内源性排泄量在绝食条件下和强饲25 g无氮饲粮条件下差异不显著(P＞0.05)，但都显著低于强饲40 g无氮饲粮条件下的相应值(P＜0.05)。

2.2 绝食条件下黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量的变异

绝食条件下，从4个批次黄羽肉鸡内源性氨基酸的含量及排泄量的变异看(表3)，内源性17种氨基酸含量的总变异系数在10.90% ～21.74%，其中批内变异系数在9.53% ～18.47%，批间变异系数在5.62% ～18.57%，这表明批内变异与批间变异比较接近。4个测定批次间，内源性14种氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、总氨基酸)的含量存在显著性差异(P＜0.05)。从绝食48 h内源性氨基酸的排泄量看，黄羽肉鸡17种内源性氨基酸排泄量的总变异系数在9.74%～19.99%，其中批内变异系数在9.97%～16.88%，批间变异系数在2.58%～16.23%，表明批内变异系数大于批间变异系数。4个测试批次间，内源性苏氨酸、胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸的排泄量差异显著(P＜0.05)，其他13种氨基酸的排泄量批间差异不显著(P＞0.05)。由于4个批次间内源性氨基酸48 h的排泄量在6.09～6.70 g/只 变 异，差 异 不 显 著 (P ＞0.05)[12]，本试验4个测定批次的内源性大多数氨基酸的含量存在显著性差异(P＜0.05)，而内源性氨基酸的排泄量上仅出现4种氨基酸的内源排泄量呈批次间的显著性差异(P＜0.05)，这表明，批次内重复间内源粪重与其氨基酸含量的乘积所累积的变异所占权重大大超过了批次间内源性氨基酸排泄量的变异。从17种内源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸和组氨酸的平均排泄量在5～10 mg/只，异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的平均排泄量在10～20 mg/只，赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，胱氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，谷氨酸、甘氨酸的平均排泄量在40～60 mg/只。

2.3 无氮饲粮条件下黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量的变异

强饲25 g无氮饲粮条件下，从4个批次黄羽肉鸡内源性氨基酸的含量及排泄量的变异看(表4)，内源性17种氨基酸含量的总变异系数在10.66%～27.13%，其中批内变异系数在7.93%～25.94%，批间变异系数在2.78% ～13.25%，这表明粪样中氨基酸含量的批内变异远大于批间变异。4个测定批次间，内源性胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸含量存在显著性差异(P＜0.05)。黄羽肉鸡内源性氨基酸48 h排泄量的总变异系数在17.77%～31.33%，其中批内变异系数在14.99%～28.80%，批间变异系数在3.89% ～17.04%，这表明批内变异大于批间变异。4个测定批次间，内源性精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的排泄量存在显著性差异(P＜0.05)。由于4个批次间内源性氨基酸48 h的排泄量在5.74～6.07 g/只变异，差异不显著(P ＞ 0.05)[12]，本试验4个测定批次的内源性胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的含量存在显著性差异(P＜0.05)，相应的精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸4种氨基酸的内源性排泄量呈批次间的显著性差异(P＜0.05)，这表明，批次间内源性氨基酸含量的变异对内源性氨基酸排泄量变异影响较大。从17种内源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸、组氨酸的平均排泄量在8～10 mg/只，异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、脯氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在50～75 mg/只。

表2 绝食法与无氮饲粮法测定试验鸡内源性氨基酸排泄量的比较Table2 Comparison of endogenous amino acid excretion of chickens using fasting method and NFD method

强饲40 g无氮饲粮条件下，从4个批次黄羽肉鸡内源性氨基酸的含量及排泄量的变异看(表5)，内源性17种氨基酸含量的总变异系数在15.40%～34.21%，其中批内变异系数在16.75%～34.73%，批间变异系数在1.60% ～14.55%，这表明批内变异远大于批间变异。4个测定批次间，内源性17种氨基酸及总氨基酸含量均不存在显著性差异(P＞0.05)。黄羽肉鸡内源性氨基酸48 h排泄量的总变异系数在16.23%～33.39%，其中批内变异系数在17.15% ～33.82%，批间变异系数在4.19% ～16.29%，这表明黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量的批内变异大于批间变异。4个测定批次间，内源性异亮氨酸、苯丙氨酸的排泄量存在显著性差异(P＜0.05)。从17种内源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸、组氨酸的平均排泄量在10～20 mg/只，异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，缬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在40～90 mg/只。

3 讨论

3.1 绝食法和无氮饲粮法测定内源性氨基酸排泄量的差异

本研究中，绝食法和无氮饲粮法测得17种内源性氨基酸中谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的排泄量均较高。这是由于内源性氨基酸主要来源于黏液、胰液、肠液、胆汁，这些成分中黏蛋白含天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸较高，胰液和小肠液中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸的含量较高，而胆汁中甘氨酸是主要氨基酸[13]。在绝食条件下，除胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的内源性损失与强饲25 g无氮饲粮条件下差异不显著外，其他14种氨基酸内源性损失均显著低于25或40 g无氮饲粮组的相应值。同时40 g无氮饲粮组苏氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸、胱氨酸的内源性损失高于25 g无氮饲粮组，表明干物质采食量影响内源性氨基酸排泄量。本研究测得黄羽肉鸡在25 g无氮饲粮组内源性氨基酸48 h排泄量为555.3 mg/只，比绝食组高 133.4 mg/只，40 g无氮饲粮组48 h内源性氨基酸排泄量比绝食组高245.1 mg/只。国内外许多研究也表明，绝食条件下鸡内源性氨基酸排泄量显著低于无氮饲粮条件下的相应值(表6)，但不同研究者所得结果存在一定差异，表明鸡内源性氨基酸的排泄量本身存在较大的变异。Sibbald[2]指出鸡内源性氨基酸损失随试验鸡体重的增加而增加。Adedokun等[15]发现5日龄艾维茵肉鸡内源性氨基酸排泄量约为15或21日龄时的2倍。此外，试验鸡的品种、环境温度、排泄物收集时间、无氮饲粮组成及强饲量等因素也会导致内源性氨基酸测值的差异。

在绝食法与无氮饲粮法测定内源性氨基酸排泄量的差异来源上，无氮饲粮可刺激肠道细胞的分泌以及磨损消化道壁，从而导致内源性氨基酸的排泄量不仅比绝食法测值高，而且还随强饲量的增加而增加，这是目前通常选用无氮饲粮估测待测饲料条件下其内源性氨基酸排泄量的理论依据。然而，在本试验中，多批次测定绝食、强饲25 g无氮饲粮、强饲40 g无氮饲粮条件下17种内源性氨基酸排泄量分别为421.9、555.3和667.0 mg/只，按照强饲量为40～50 g(饲粮蛋白质水平约为20%)，氨基酸的总摄入量约为8 000 mg推算，内源性氨基酸排泄量对氨基酸消化率的贡献分别为5.3%、6.9%、8.3%。绝食法与无氮饲粮法引起的饲料氨基酸消化率的差异可达3%。40 g无氮饲粮组与25 g无氮饲粮组引起的饲料氨基酸消化率的差异达1.4%。

3.2 内源性氨基酸测定的变异对饲料氨基酸真消化率测定的影响

在内源性氨基酸测定的变异上，目前尚鲜见关于其批次间变异的相关报道。而在生物学法测定鸡饲料代谢能值的变异上，Bourdillon等[16]报道，欧洲7个实验室采用自由采食-全收粪法测定4个肉仔鸡饲粮的氮校正表观代谢能(AMEn)的再现性的变异系数为2.92%。这一变异系数高于干物质、粗蛋白质、粗脂肪的重现性变异系数，但低于粗灰分和粗纤维的重现性变异系数。在本试验测定的同时，已得出黄羽肉鸡玉米淀粉饲粮强饲量为25 g时，4个测定批次的真代谢能(TME)变异系数为1.60%。当玉米淀粉饲粮强饲量为40 g时，4个测定批次的TME的变异系数为4.65%[12]。本试验中，绝食组、25 g无氮饲粮组、40 g无氮饲粮组内源性氨基酸排泄量的总变异系数分别为 9.74% ～19.99%、17.77% ～31.33%、16.23% ～33.39%。其总变异系数、批内变异系数、批间变异系数均大大高于代谢能值的变异系数，这可能与内源性氨基酸排泄量(每48 h 0.4～0.6 g)比较低，而且鸡个体间在内源性氨基酸排泄量上差异比较大有关。

在饲粮强饲量为40～50 g(饲粮蛋白质水平约为20%)，氨基酸的总摄入量约为8 000 mg的前提下，绝食组4个测定批次间内源性氨基酸排泄量最大相差63.3 mg，25 g无氮饲粮组4个测定批次间的内源氨基酸排泄量最大相差119.0 mg，40 g无氮饲粮组4个测定批次间的氨基酸排泄量最大相差110.4 mg，则绝食组、25 g无氮饲粮组、40 g无氮饲粮组的重复测定批次间的差异引起氨基酸消化率的差异分别为0.8%、1.5%和1.4%，表明采用绝食法所测内源性氨基酸损失对饲料氨基酸消化率测定结果的干扰相对较小。

?

?

?

?

?

?

?

表6 试验鸡内源性氨基酸排泄量的比较Table6 Comparison of endogenous amino acid excretion of chickens

4 结论

①绝食组、25 g无氮饲粮组、40 g无氮饲粮组内源性氨基酸排泄量依次增加，3个组内源性氨基酸排泄量总变异系数均较大，批内变异系数均大于批间变异系数。

②采用绝食法测定的内源性氨基酸排泄量对饲料氨基酸真消化率测定结果的干扰小于无氮饲粮法。

[1]SIBBALD I R.A bioassay for available amino acids and true metabolizable energy in feeding stuffs[J].Poultry Science，1979，58:668-673.

[2]SONG G L，LI D F，PIAO X S，et al.Comparisons of amino acid availability by different methods and metabolizable energy determination of a Chinese variety of high oil corn[J].Poultry Science，2003，82:1017-1023.

[3]KLUTH H，RODEHUTSCORD M.Effect of inclusion of cellulose in the diet on the inevitable endogenous amino acid losses in the ileum of broiler chickens[J].Poultry Science，2009，88:1199-1205.

[4]SIBBALD I R.A bioassay for true metabolizable energy in feedstuffs[J].Poultry Science，1976，55:303-308.

[5]MCNAB J M，FISHER C.The choice between apparent and true metabolizable energy systems-recent evidence[C]//Proceedings of the 3rd European symposium on poultry nutrition.Edinburgh:[n.s.]，1981:45-55.

[6]ENGSTER H M，CAVE N A，LIKUSKI H，et al.A collaborative study to evaluate a precision-fed rooster assay for true amino acid availability in feed ingredients[J].Poultry Science，1985，64:487-498.

[7]黎观红，瞿明仁，朱年华，等.泰和鸡内源氨基酸排泄量的研究[J].动物营养学报，2002，4(1):42-44.

[8]翟少伟，曹平华.两种常用方法测定鸡内源氨基酸损失量的比较研究[J].西北农业学报，2003，12(2):10-13.

[9]MUZTAR A J，SLINGER S J.Effect of level of dietary fiber on nitrogen and amino acid excretion in the fasted mature rooster[J].Nutrition Reports International，1980，22:863-868.

[10]LIKUSKI H J A，DORRELL H G.A bioassay for rapid determination of amino acid availability values[J].Poultry Science，1978，57:1658-1660.

[11]全国饲料工业标准化技术委员会.GB/T 26437—2010畜禽饲料有效性与安全性评价——强饲法测定鸡饲料表观代谢能技术规程[S].北京:中国标准出版社，2010.

[12]REN L Q，TAN H Z，ZHAO F，et al.Applicability of corn starch as basal diet in determining the true metabolizable energy of protein feedstuffs in Chinese yellow chickens[J].Poultry Science，2012，91:1394-1399.

[13]CHUNG T K，BAKER D H.Apparent and true amino acid digestibility of a crystalline amino acid mixture and of casein:comparison of values obtained with ileal-cannulated pigs and cecectomized cockerels[J].Journal of Animal Science，1992，70:3781-3790.

[14]PARSONS C M，POTTER L M，BROWN R D.Effects of dietary carbohydrate and of intestinal microflora on excretion of endogenous amino acids by poultry[J].Poultry Science，1983，62:483-489.

[15]ADEDOKUN S A，LILBURN M S，PARSONS C M，et al.Endogenous amino acid flow in broiler chicks is affected by the age of birds and method of estimation[J].Poultry Science，2007，86:2590-2597.

[16]BOURDILLON A，CARRE B，CONAN L，et al.European reference method for the in vivo determination of metabolisable energy with adult cockerels:reproducibility，effect of food intake and comparison with individual laboratory methods[J].British Poultry Science，1990，31(3):557-565.