消栓肠溶胶囊对中动脉栓塞大鼠新异性探索行为及树突重塑的影响

赵晖 王蕾 王春雪 张宁 张建 王雅丽

消栓肠溶胶囊对中动脉栓塞大鼠新异性探索行为及树突重塑的影响

赵晖 王蕾 王春雪 张宁 张建 王雅丽

目的 观察消栓肠溶胶囊对中动脉栓塞大鼠新异性探索行为以及海马微管相关蛋白2（microtubuleassociated protein 2，MAP-2）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、β淀粉样蛋白-42（β-amyloid-42，Aβ42）表达的影响。方法 采用线栓法建立大鼠中动脉栓塞模型。将90只大鼠随机分成假手术组、模型组、消栓肠溶胶囊组（再按体质量420、140、47 mg/kg分3个剂量亚组）、脑心通胶囊组（阳性药物组），连续灌胃给药15 d，1次/d。在造模第15天进行旷场实验；采用免疫荧光染色法检测海马MAP-2和BDNF的表达；免疫组化法检测海马Aβ42的表达。结果 模型组大鼠在旷场中央区、边缘区（四个角及四个边）的活动路程减少；经消栓肠溶胶囊140 mg/kg治疗后，大鼠旷场活动总路程及边缘区活动路程较模型组明显增加（＜0.05）。和假手术组相比，模型大鼠海马MAP-2、BDNF表达下调，Aβ42表达增强（均＜0.05）；与模型组比较，消栓肠溶胶囊140 mg/kg治疗组大鼠海马MAP-2表达明显增强（＜0.05），消栓肠溶胶囊140 mg/kg、47 mg/ kg治疗组大鼠海马BDNF表达升高，Aβ42表达降低（均＜0.05）。结论 消栓肠溶胶囊可提高脑缺血大鼠在新异性环境中的探索能力，并通过提高内源性神经营养因子表达，抑制Aβ42异常聚集，减少神经元损害，增强海马神经元树突的可塑性。

消栓肠溶胶囊；脑缺血；旷场；微管相关蛋白2；脑源性神经营养因子；β淀粉样蛋白-42

脑卒中后，患者不仅出现躯体残疾，还可出现认知功能减退、情绪低落、兴趣丧失、注意力下降、睡眠障碍、焦虑易激惹多种神经精神症状［1］。补阳还五汤为清代医家王清任创立的治疗缺血性卒中后遗症的中药复方，对脑梗死引发的肢体功能障碍、认知障碍具有独特的临床疗效［2-3］。消栓肠溶胶囊是以补阳还五汤为组方的国家中药保护品种，胶囊剂型解决了汤剂煎煮、携带不便的问题，同时药品质量可控，更好地适应了临床需要。本实验通过旷场实验观察中动脉栓塞大鼠探索新异环境的行为变化，评价消栓肠溶胶囊对脑缺血大鼠神经精神症状的影响，并探讨海马微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、β淀粉样蛋白-42（β-amyloid-42，Aβ42）的表达及其作用机制，为脑卒中患者的康复治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠90只，体质量300～350 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。饲养在首都医科大学实验动物中心SPF级实验室，动物实验设施许可证号：SYXK（JING）2010-0020。将大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、消栓肠溶胶囊3个剂量组（420、140、47 mg/kg）和阳性对照组（脑心通胶囊600 mg/kg），每组15只大鼠。

1.2 主要试剂和仪器 包括消栓肠溶胶囊（三门峡赛诺维制药有限公司），MAP-2、Aβ42、BDNF（EPITOMICS公司），脑心通胶囊（陕西步长制药有限公司），山羊抗兔lg G/Dylight TM488、山羊抗兔lgG/Alexa Fluor®594、兔超敏二步法检测试剂盒（北京中杉金桥公司），栓线（北京沙东生物技术有限公司），Eclipse生物显微镜、图像采集分析系统（Nikon公司），大鼠自发活动分析系统（上海吉量软件科技有限公司，JLBehv-LAR）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠中动脉栓塞模型制备：参照文献［4］线栓法制备大脑中动脉栓塞永久性缺血模型。大鼠麻醉后，仰卧位固定，将栓线（直径0.265 mm，长4 cm）置于颈内动脉18 mm处，扎紧动脉残端，缝合皮肤。假手术大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉。术中、术后室温控制在24～25℃之间，大鼠体温维持在36.5～37.5℃之间。大鼠麻醉清醒后出现不能完全伸展左前肢、行走时向左侧倾倒或转圈者纳为实验对象。最终模型组10只，消栓肠溶胶囊3个剂量组（420、140、47 mg/ kg）分别为9只、9只、12只，脑心通胶囊组8只，假手术组随机选取8只用于实验。

1.3.2 给药：根据药理实验动物与人体临床等效剂量换算关系确定消栓肠溶胶囊的给药剂量。消栓肠溶胶囊的临床用量为1.2 g/d，即20 mg/kg（按60 kg/人折算），消栓肠溶胶囊大鼠用剂量140 mg/kg（相当于临床用剂量的7倍），420 mg/kg（相当于临床用剂量的21倍），47 mg/kg（相当于临床用剂量的3倍）。手术造模2 h后各干预组给药1次，造模24 h后再次灌胃给药，连续给药15 d，每天1次。假手术组、模型组灌胃等容量生理盐水。

1.3.3 旷场实验：大鼠中动脉栓塞第15天进行旷场实验。实验在1个540 cm×590 cm×690 cm的封闭箱中进行，箱子顶部中央安置有摄像机，将大鼠放置在箱子中心处，让其自由活动5 min。采用自发活动分析系统记录并分析大鼠活动总路程、中央区活动路程、四个角及四个边的活动路程。

1.3.4 取材与标本处理：动物行为学实验结束后，各组随机取4只大鼠麻醉，4%（质量浓度）多聚甲醛心内灌注固定，恒定灌注时间60 min，待固定充分，开颅取脑，将脑组织置大鼠脑模具固定，参照大鼠脑立体定位图谱，切取视交叉后4 mm组织块，投入相同固定液于4℃固定1周后，常规石蜡包埋、切片。

1.3.5 MAP-2、BDNF免疫荧光染色：脑组织切片经柠檬酸缓冲液（p H6.0）高热修复20 min；10%（体积分数）羊血清封闭1 h；经兔抗MAP-2（1∶700）、BDNF（1∶100）4℃孵育40 h，每片滴加山羊抗兔（1∶800），室温孵育2 h后，0.01 mol/L PBS洗涤，DAPI封片。在激发/发射波长470/490 nm条件下，MAP-2阳性细胞呈现绿色荧光。在激发/发射波长540/580 nm条件下，BDNF阳性细胞呈现红色荧光。

1.3.6 Aβ42免疫组织化学染色：脑组织切片经柠檬酸缓冲液（p H6.0）微波修复20 min；10%（体积分数）羊血清封闭1 h；经兔抗Aβ42（1∶50）4℃孵育40 h后，二抗试剂1孵育30 min，试剂2孵育1 h；DAB试剂显色90 s，中性树胶封片。

1.3.7 图像采集与分析：在Olympus光学显微镜下观察免疫染色切片，采集每张切片缺血侧（右侧）海马CA1区相互不重叠的3个视野，采用NIS-Elements Basic Research图像分析系统对BDNF、MAP-2和Aβ42阳性表达进行分析，以积分吸光度（IOD，integrated optical density）反映阳性表达的免疫强度。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据符合正态性和方差齐性，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠旷场行为学比较 模型组大鼠旷场活动减少，在旷场中央区、边缘区（四个角及四个边）活动路程以及活动总路程均明显少于假手术组（＜0.05）；经消栓肠溶胶囊140 mg/kg、脑心通胶囊干预后，大鼠在旷场活动路程增加，特别是四个角及四个边的活动路程显著大于模型组（＜0.05）（表1）。

2.2 各组大鼠脑组织MAP-2、BDNF和Aβ42的表达 具体结果见表2、图1～3。假手术组大鼠海马结构CA1-3区辐射层和腔隙层内可见密集、丛状的MAP-2阳性神经元突起，即树突；Aβ42阳性表达主要位于神经元核周体及周围的轴突部位。与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区MAP-2、BDNF阳性细胞表达明显减弱，Aβ42阳性表达增强（均＜0.05）。与模型组比较，消栓肠溶胶囊中剂量组（140 mg/kg）大鼠海马区MAP-2阳性细胞表达明显增强（＜0.05），消栓肠溶胶囊140 mg/kg、4 7 mg/kg及脑心通胶囊组大鼠海马BDNF阳性细胞表达明显增强，而Aβ42表达明显下调（均＜0.05）。

表1 各组大鼠在旷场中的新异性探索行为 （±）

表2 各组大鼠海马各指标表达的IOD比较 （±，=4）

表2 各组大鼠海马各指标表达的IOD比较 （±，=4）

注：消栓A组、B组、C组分别为消栓肠溶胶囊420、140、47 mg/kg剂量组；与模型组比较，*＜0.05

组别 MAP-2 BDNF Aβ42假手术组 42623.08±21946.28* 14708.01±5135.45* 488.87±124.23*模型组 22624.39±10801.05 8462.09±2664.11 2089.67±538.08消栓A组 27940.96±13103.00 11377.15±3935.44 2123.17±475.63消栓B组 37644.50±24736.71* 18682.21±4180.83* 1500.36±784.43*消栓C组 25679.33±17709.10 13378.27±3415.57* 1712.73±383.90*脑心通胶囊组 28411.56±15621.24 16660.71±5644.73* 1774.38±721.76*值2.370 15.101 14.58值0.033 0.000 0.000

图1 各组大鼠海马区MAP-2的表达（箭头所示，免疫荧光染色，比例尺=50.0μm）

图2 各组大鼠海马区BDNF的表达（箭头所示，免疫荧光染色，比例尺=50.0μm）

3 讨论

新异性探索行为是动物对新环境新刺激表现出的兴奋行为，体现了动物对新行为的获得与发展、保持与再现的应激能力，属于学习记忆过程［5］。旷场行为实验是比较经典的动物行为学指标，能够有效评价动物对新环境的探索、认知能力以及伴随的抑郁、焦虑、紧张等情绪变化［6-8］。此研究结果显示中动脉栓塞15 d模型组大鼠在旷场中央及周边的活动较假手术组明显减少，表明脑缺血损伤可降低大鼠对新环境的探究兴趣，减少动物在新异环境中的探索行为。既往相关研究结果亦显示，脑组织受损后，大鼠旷场活动路程减少，中央停留时间、跨格次数减少［9-10］。这与该实验结果一致。

图3 各组大鼠海马区Aβ42的表达（箭头所示，免疫组化，DAB显色，比例尺=50.0μm）

海马脑区与情绪、认知关系密切，中动脉栓塞后，不仅缺血中心区的结构功能发生明显变化，在远离梗死区的海马也发生病理性改变。MAP-2为神经元树突重塑的标志蛋白［11］，对缺血损伤非常敏感，其活性下降可造成微管变性堆积，影响细胞骨架的完整，并可使线粒体的轴突转运发生障碍，最终导致神经元死亡［12］。该实验发现中动脉栓塞15 d模型大鼠海马脑区MAP-2表达较假手术组明显减弱，结合模型组大鼠旷场探索行为的变化，提示局灶性脑缺血会损伤远隔脑区海马树突数量、结构和功能，影响神经元之间的信息传递，最终导致认知功能损害及精神障碍。

补阳还五汤为临床上治疗缺血性脑中风的有效复方［13-15］。消栓肠溶胶囊为补阳还五汤经现代工艺技术制备而成的胶囊剂。该研究发现消栓肠溶胶囊可提高局灶性脑缺血大鼠在新异性环境中的探索能力，增强MAP-2的免疫活性，提高海马神经元树突可塑性。

Aβ、BDNF在神经元损伤修复中的作用受到普通关注。Aβ为β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的代谢产物。APP作为正常神经元跨膜糖蛋白，由轴突的快轴浆运输通道运输［16］，当轴索损伤，APP异常聚集并经淀粉样降解途径代谢后可产生Aβ42，Aβ42具有神经毒性，可促发炎性反应级联反应，损伤轴突，导致突触丢失［17］。BDNF作为神经营养因子家族中的一员，主要在神经元合成，经轴突运输，通过与其特异性膜受体酪氨酸激酶B（trk B）结合，参与神经元突触的发育、存活、分化和轴突再生，在学习记忆中起重要调节作用［18］。

本研究结果显示，中动脉栓塞后，大鼠海马BDNF表达明显下调，Aβ42免疫反应增强，分析其原因可能为：脑缺血后，物质代谢和蛋白质合成能力下降，神经元细胞骨架崩溃，轴突运输障碍，因而内源性神经营养因子BDNF合成、分泌不足，同时由于Aβ42聚集和沉淀，触及多种神经毒性机制，干扰脑内神经元突触间的长时程增强作用而影响突触的可塑性，影响学习记忆功能［19］。

既往研究结果显示，补阳还五汤可通过改善局部脑血流量和细胞能量代谢、抗血栓形成、促进轴索损伤后的修复，减轻神经功能缺失，改善学习记忆功能［20-21］。该研究进一步发现消栓肠溶胶囊可明显上调中动脉栓塞大鼠海马脑区BDNF表达，降低Aβ42免疫阳性反应，提示消栓肠溶胶囊一方面可通过提高内源性神经营养因子表达，保护受损神经元；另一方面通过抑制Aβ聚积和毒性作用，提高海马神经元树突的可塑性，对改善脑梗后精神障碍具有积极的治疗意义。

该实验选择脑心通胶囊为阳性药物对照，脑心通胶囊组方源于补阳还五汤，是在补阳还五汤的基础上，增加水蛭、全蝎虫类药及丹参、当归、红花等活血化瘀中药组成的现代中药方剂，具有益气活血、化瘀通络之效，为临床治疗缺血性中风的常用中成药。其有关药理研究结果显示，脑心通胶囊可降低血浆纤维蛋白原含量，抑制血小板聚集，改善微循环及能量代谢障碍，对抗谷氨酸、自由基毒性损伤，减少细胞凋亡［22］。此研究发现，经脑心通胶囊治疗后大鼠在新异性环境中的探索能力明显增强，海马脑区BDNF表达增加，Aβ42免疫阳性反应下调，但MAP-2表达较模型组无统计学差异，而消栓肠溶胶囊140 mg/kg组大鼠海马MAP-2表达较模型组明显增强。而MAP-2参与胞浆蛋白运输和树突生长，是脑缺血缺氧后神经细胞受损及再生的指标之一。因此该研究结果提示，脑心通胶囊和消栓肠溶胶囊的作用环节可能并不完全一致，消栓肠溶胶囊促进海马树突重塑的作用可能较脑心通胶囊更具优势，其机制尚需进一步深入研究。由于本研究仅通过免疫荧光、免疫组化的方法观察海马脑区MAP-2、BDNF、Aβ42的表达，实验方法较单一，在后续实验中应进一步利用Western blot检测技术对海马MAP-2、BDNF，Aβ42蛋白进行定量检测，通过多种技术手段和方法对消栓肠溶胶囊促进脑功能康复作用进行评价。

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WANG Ya-li，Email：2279053229@qq.com

Objective The present study was designed to investigate the effects of Xiaoshuan entericcoated capsule on novelty-seeking behavior and expressions of microtubule-associated protein 2（MAP-2），brain derived neurotrophic factor（BDNF），andβ-amyloid-42（Aβ42）in the hippocampal region in middle cerebral artery occlusion（MCAO）model rats.Methods A rat stroke model was obtained through MCAO.The male SD rats were randomly divided into sham-operation group，model group，Xiaoshuan enteric-coated capsule（0.42，0.14，0.047 g/kg）group，and Naoxintong capsule group.They were given a 15-day continuous treatment.The open field test was measured 15 d after ischemia.Imunofluorescence staining was used to observe the expression of MAP-2 and BDNF.The expression of Aβ42 was detected by immunohistochemistry.Results Compared to control rats，MCAO rats displayed poorer adaptability to new environment in the open-field test（＜0.05）.The expressions of MAP-2 and BDNF were decreased and the expression of Aβ42 was increased（＜0.05）.Distance of open-field test was increased in Xiaoshuan enteric-coated capsule 140 mg/kg group rats compared with the model group 15 d after ischemia（＜0.05）.The expression of MAP-2 in hippocampus was increased in Xiaoshuan enteric-coated capsule 140 mg/kg group rats compared with the model group（＜0.05）.The expression of BDNF was increased and the expression of Aβ42 was decreased in Xiaoshuan enteric-coated 140 mg/kg and 47 mg/kg group rats compared with the model group（＜0.05）.Conclusions These data suggest that improved adaptability to new environment in cerebral ischemic rats treated by Xiaoshuan enteric-coated capsule is associated with enhanced hippocampal dendrites plasticity.

Xiaoshuan enteric-coated capsule；cerebral ischemia；the open field test；microtubule-associated protein 2；brain derived neurotrophic factor；β-amyloid-42

R743.3

：A

：1006-2963（2014）06-0401-06

2014-08-14）

（本文编辑：时秋宽）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.006

国家自然科学基金资助项目（No.30973782；No.81473745）；北京市自然科学基金资助项目（No.7122018）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划-长城学者项目（CIT&TCD20140329）；北京市属高等学校人才强教深化计划“中青年骨干人材培养计划”项目（No.PXM2011014226）

100069首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室（赵晖、王蕾、张建、王雅丽）；100050首都医科大学附属北京天坛医院神经内科（王春雪、张宁）

王雅丽，Email：2279053229@qq.com