不同储存条件和反复冻融对血清和血浆乙酰胆碱受体抗体水平的影响

郝洪军 洪宇 谢琰臣 李海峰

不同储存条件和反复冻融对血清和血浆乙酰胆碱受体抗体水平的影响

郝洪军 洪宇 谢琰臣 李海峰

目的 探讨不同储存条件和反复冻融对血清和血浆乙酰胆碱受体抗体（ACh RAb）水平的影响。方法 将1例重症肌无力患者的血清和血浆标本分成数等份，置于不同储存条件下（常温、4℃或—80℃）并经过不同次数的冻融，不同等分的样本使用同一批次商品化ELISA试剂盒双平行孔检测AChRAb水平。计算各种条件下血清和血浆标本ACh RAb抑制率的变异系数（），比较不同处理条件下的抑制率以及同一条件下血清和血浆标本的抑制率。结果 除常温条件下血浆标本＞10%外，其余条件下均＜10%。4℃条件下血清AChRAb的抑制率显著高于其他条件下血清的抑制率（＜0.05），4℃和常温条件下血浆的抑制率显著低于其他条件下血浆标本的抑制率（＜0.05）。4℃条件下血清和血浆标本ACh RAb抑制率差异有统计学意义（＜0.05），而冷冻保存后经过多达5次冻融两者的抑制率差异无统计学意义（＞0.05）。结论 —80℃直接储存的血清和血浆标本，即使经过多次冻融，ACh RAb水平检测结果仍可较为一致。血清标本在常温、4℃或冷冻保存，血浆标本低温冷冻保存，数日内完成检测结果具有一致性。

重症肌无力；乙酰胆碱受体抗体；储存条件；冻融

乙酰胆碱受体抗体（anti-acetylcholine receptor antibody，ACh RAb）是重症肌无力（myasthenia gravis，MG）的主要的生物标志物，AChRAb检测在MG的诊断和疗效评价具有重要价值［1］。传统的ACh RAb检测方法是放射免疫沉淀法，ELISA法因其无放射性和容易开展而应用日渐广泛，目前已有商品化的ELISA试剂盒应用于临床。目前，国内只有少数 MG诊治中心能够检测ACh RAb，待测标本经常需要在常温或4℃环境运送至MG诊疗中心；研究所用标本通常于—80℃环境冻存后进行批量检测，标本可能会经过重复检测及反复冻融。而且，有时只有血浆标本可供检测，然而该ELISA试剂盒要求使用血清标本。目前尚缺乏血清/血浆中ACh RAb水平在不同温度环境下稳定性的研究，冻融对ACh RAb水平的影响亦未曾充分评估，血清和血浆标本采用ELISA法检测的结果是否存在差异也无相关研究。基于以上问题，本文作者将1例MG患者的血清和血浆标本分成数等份，同时分别置于不同储存条件下并经过不同次数冻融，对该ELISA试剂盒检测的ACh RAb水平进行比较。

1 对象和方法

1.1 观察对象 标本采集自1例25岁男性Ⅱb型MG患者，其MG病史3个月，无其他疾病病史。该患者的肌无力症状从眼外肌开始逐渐累及面部和肢体肌肉，标本采集时的QMG评分为10分。筛查未发现合并感染及其他自身免疫病。胸部CT检测发现胸腺瘤，标本采集前已行胸腺切除，病理示B2型胸腺瘤。标本采集前未行免疫治疗。患者已知情同意。

1.2 方法 患者于上午10点左右在神经科门诊采集血液标本（不要求空腹）10 m L，采集试管为标准真空血清试管和标准真空EDTA抗凝试管，于室温（20℃）于1800 r/min离心（离心半径13.5 cm）8 min后留取血清，于3000 r/min离心（离心半径13.5 cm）8 min后留取血浆。所有步骤均于半无菌条件下完成。

血清和血浆标本均分成多个相同的小份。每种条件（表1）均检测血清和血浆同样的小份标本，以观察储存和冻融条件对检测结果一致性的影响，比较血清和血浆标本检测结果的一致性。每种条件均检测3小份标本，以减少操作带来的偶然误差的影响。每份标本均按照ACh RAb试剂盒（RSR Ltd.，Cardiff，UK）的说明书用酶标仪（BIORAD-Model 680）进行平行孔检测［2］。对每小份标本计算其两平行孔抑制率的均值，作为该小份标本的抑制率。抑制率=100×﹝1—（λ）标本/（λ）阴性对照﹞。计算每种处理条件下3小份标本抑制率的平均值和标准差，以及该条件下结果的变异系数（coefficient of variability，），=（标准差/平均值）×100，可以反映检查结果的稳定性（批内聚集性）。

1.3 统计学处理 不同处理条件下（5组）抑制率比较采用单因素方差分析（ANOVA），判断不同保存条件对结果一致性的影响。对总体差异有统计学意义者，运用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）进一步进行多重比较。同一处理条件下的血清和血浆标本的抑制率比较采用配对 检验，以评价血清和血浆标本结果的一致性。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各种条件下的血清或血浆ACh RAb的抑制率值见表1。除了血浆标本在E条件外，其余各条件下各标本AChRAb抑制率的均小于10%。在不同条件下血清标本ACh RAb抑制率差异有统计学意义（＜0.05），进一步分析显示D条件下抑制率高于其余条件。血浆标本ACh RAb的抑制率在不同条件下差异亦有统计学意义（＜0.05），进一步分析显示D和E条件下的抑制率低于其余条件（＜0.05）。

表1 不同储存条件和冻融次数对血清/血浆AChRAb抑制率的影响 （=3）

表1 不同储存条件和冻融次数对血清/血浆AChRAb抑制率的影响 （=3）

注：与条件E比较，*＜0.05；与条件D比较，#＜0.05；值、值为血清和血浆标本结果比较所得

处理条件 血清均值 标准差血浆均值 标准差值值A —80℃保存8 d 62.9#4.57 7.3 60.3*#2.3 3.8 0.69 0.560 B —80℃保存8 d，分别于第1、3和5天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷冻62.1#1.85 3 60.1*#3.13 5.2 1.74 0.224 C 在—80℃保存8 d，分别于第1、2、3、5和7天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷冻59.4#5.07 8.5 60.8*#3.75 6.2—0.76 0.528 D 4℃保存8 d69.4*1.44 2.1 51.7 3.69 7.1 6.69 0.021 E 室温保存8 d 62 3.23 5.2 47.8 6.95 14.6 2.52 0.128

同一条件下血清和血浆标本抑制率除D条件血清标本抑制率高于血浆标本（＜0.05）外，其余处理条件下差异无统计学意义（表1）。

3 讨论

本研究所用标本为来自同一患者的同一标本，以期在其他方面相同的情况下观察保存条件对AChRAb检测结果一致性的影响，以及血清和血浆标本检测结果的一致性。血清或血浆标本均含有降解酶，在4℃、室温或低温储存条件下，标本中的蛋白类分子的降解程度可能存在不同，导致抗体蛋白含量减少和/或结合能力下降。血清和血浆的主要区别在于血浆含有丰富的纤维蛋白原，对一些生物分子有黏附作用，黏附的生物分子可能影响抗体的稳定性和/或结合能力。

2010年，Hewer等［3］提出了一种新的ELISA方法，其特异性和敏感性与放射免疫沉淀法相近。该方法原理是将纯化的胎儿型和成人型ACh R混合物包被在酶标板，待测血清中的ACh RAb与几种不同的AChR单克隆抗体竞争性结合AChR。待测血清中ACh RAb浓度越高，其对生物素标记的AChR单克隆抗体结合的竞争性抑制越强，因此可以用抑制率反映ACh RAb的水平。由于该方法方便可靠且逐渐普及，本文作者采用该ELISA试剂盒检测ACh RAb，初步观察不同保存条件对ACh RAb检测结果一致性的影响，以及对血清和血浆标本检测结果的一致性的影响。

本实验标本检测所得到的AChRAb抑制率均显著高于16%的阳性界值，也低于本研究所用ELISA试剂盒说明书中标准曲线的高限［2］。大部分处理条件下小于10%，即使直接储存于—80℃并在随后反复冻融多达5次的标本检测结果也较为一致。然而，常温放置8 d的血浆标本的超过10%。有研究报道，在不同储存条件和反复冻融后检测血清中水通道蛋白4抗体（antiaquaporin-4 antibody，AQP4Ab）水平，发现常温运送标本和经过反复冻融并未使血清中AQP4抗体的稳定性降低［4］。本实验除了4℃保存血清标本的抑制率略偏高外，其余处理条件下血清抑制率差异无统计学意义。因为该条件下的很小，而其余4种条件下的中有些较大，推测该条件下结果偏高可能是由于偶然误差所致。血清标本检测结果提示血清标本在常温或4℃保存8 d后其抗体水平均能保持相对稳定，抗体水平亦未受到标本冷冻后反复冻融的影响。

本实验血浆标本在D和E处理条件下的抑制率较其余3种条件下低，而A、B和C条件下差异无统计学意义。当血浆标本储存于4℃或常温时，前述机制使AChRAb稳定性下降的原因可能是D和E条件下抑制率低。血清和血浆标本结果的绝对差在D和E条件下较大，导致无法使用常温或4℃保存的血浆标本代替血清标本进行检测。而直接保存于—80℃的血清和血浆标本即使经过多达5次冻融，其ACh RAb水平检测结果差异也无明显变化。

本研究结果提示，临床检测ACh RAb水平时，血清标本可在常温、4℃或冷冻保存，血浆标本需要冷冻保存，检送标本前先分离血清或血浆且于采血后数日内完成检测均可得到可靠结果。而且，血清和血浆标本在—80℃保存即使经过多达5次冻融也可以保持检测AChRAb水平稳定，在实验室研究中需要成批检测ACh RAb水平时使用冷冻的血浆标本代替血清标本可以获得较为一致的结果。

［1］Gomez AM，Van Den Broeck J，Vrolix K，et al.Antibody effector mechanisms in myasthenia gravis-pathogenesis at the neuromuscular junction［J］.Autoimmunity，2010，43（5-6）：353-370.

［2］AChRAb ELISA Kit（96 wells）［EB/OL］.http：//www. rsrltd.com/IFU.html.

［3］Hewer R，Matthews I，Chen S，et al.A sensitive nonisotopic assay for acetylcholine receptor autoantibodies［J］.Clin Chim Acta，2006，364（1-2）：159-166.

［4］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze/thaw cycles on aquaporin-4 antibody（NMO-IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（12）：2121-2122.

LI Hai-feng，Email：drlhf@163.com

Objective To evaluate the intra-assay reproducibility of anti-acetylcholine receptor antibody（ACh RAb）level in serum and plasma samples among various pre-treatment conditions consisting of different storage schemes and subsequent freeze/thaw cycles.Methods The serum and plasma samples were collected from a patient with myasthenia gravis and allocated in aliquots pre-treated in various conditions（stored at room temperature［RT］，4℃or—80℃with subsequent freeze/thaw cycles）.Each aliquot was examined in duplicate with commercial ACh RAb ELISA kit.The coefficient of variability（）was calculated for inhibition rate of AChRAb in each pre-treatment condition.Inhibition rates of AChRAb in serum or plasma samples were compared among each condition，and compared between serum and plasma samples in each condition.Results Except for plasma sample at RT，thes of all the other samples in various conditions were＜10%。The inhibition rate of AChRAb in serum sample was significantly higher at 4℃than those in other conditions（＜0.05）.The inhibition rate in plasma samples were significantly higher at 4℃and RT than those in other conditions（＜0.05）.There were significant difference in inhibition rates between serum and plasma samples at 4℃（＜0.05），while no difference was found in frozen conditions with up to five subsequent freeze/thaw cycles（＞0.05）.Conclusions There was good intra-test reproducibility of the ELISA kit in determining the AChRAb levels in serum and plasma samples stored at—80℃directly with various subsequent freeze/thaw cycles.There was good intra-test reproducibility in serum samples stored at RT，4℃and frozen conditions and in plasma samples stored in frozen conditions，which were examined in several days after blood collection.

myasthenia gravis；acetylcholine receptor antibody；storage condition；freeze/thaw

R746.1

：A

：1006-2963（2014）06-0394-03

2013-08-09）

（本文编辑：邹晨双）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.004

国家自然科学基金资助项目（81070963，30700242）；山东省自然科学基金资助项目（ZR2010HM019）

100034北京大学第一医院神经内科神经免疫室（郝洪军）；266003青岛大学附属医院神经内科（洪宇）；100050首都医科大学友谊医院神经内科（谢琰臣）；250012山东大学齐鲁医院神经内科（李海峰）

李海峰，Email：drlhf@163.com