汉坦病毒S基因的克隆及体外转录

郝丽娜，胡丹，吕恒，张锦海，张凤玉，龚秀芳，

李丙军2，朱进2，潘秀珍 2，姚苹苹3，张云2，王长军1，2，陈建华1

1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.南京军区 军事医学研究所，江苏 南京 210002；

3.浙江省疾病预防控制中心，浙江 杭州 310051

汉坦病毒（Hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，在我国汉坦病毒主要引起肾综合征出血热，临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，流行病原主要以汉滩型（HTN）76118株和汉城型（SEO）R22株为主[1-2]。

汉坦病毒是单股负链RNA病毒，其基因组由大（L）、中（M）、小（S）3个片段组成，分别编码病毒RNA聚合酶、膜蛋白G1和G2及核衣壳蛋白（NP）[3]。病毒表面的糖蛋白G1和G2是型特异性抗原，可刺激机体产生中和抗体。NP是主要群特异性抗原，比病毒编码的其他蛋白易于表达且有更好的免疫原性，可刺激机体产生补体结合抗体，在急性感染期NP抗体即可达到很高的滴度，故常作为诊断用抗原[4]。

我们将HTN型和SEO型病毒编码NP的S基因克隆至含双启动子的PCRⅡ载体，进行体外转录，获得含目的基因序列的RNA转录体，并经一步法荧光定量PCR检测[5]，得到可用于汉坦病毒检测的阳性标准品。本研究可为基层快速检测汉坦病毒方法的建立和改进提供阳性定量标准品，对汉坦病毒致病机制、基因组功能、疫苗构建等研究也有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1～5 d龄的乳沙鼠购自军事医学科学院；汉坦病毒HTN型76118株及SEO型R22株为本实验室保存；载体PCRⅡ-T Vector购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、Ribopmbe System-T7体外转录试剂盒购自Promega公司；SpeⅠ、SacⅠ内切酶、T4DNA聚合酶、250 bp DNA marker、质粒提取试剂盒、Prime⁃Script RT Master Mix反转录试剂盒、DNA纯化试剂盒、One Step PrimeScript RT-PCR试剂盒购自TaKa⁃Ra公司；RNA纯化试剂盒购自TIANGEN公司。

1.2 引物合成

根据GenBank中76118株和R22株的S基因序列设计扩增引物，由上海赛百盛公司合成。引物HTN1P（5'-ATGCATGCGGCCGCTACCATGGCAAC TATGGAGG-3'）和 HTN2P（5'-GATCGTCGACTTA GATCTAGAGTTTCAAAGGCTC-3'）用于扩增 76118株S基因（1290 bp），引物SEO1P（5'-GGAATTCCG AAAAATGGCAACTATGGAAGAAA-3'）和 SEO2P（5'-GCTGCAGCACCCGTGATTATACATAGCAGTGA-3'）用于扩增R22株S基因（1558 bp）。

1.3 提取RNA

将2株病毒接种1～5 d龄乳沙鼠，每只脑内接入0.02 mL，15 d左右收获发病小鼠，无菌取脑，研磨脑组织，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，1%琼脂糖电泳及分光光度计（Onedrop 1000）检测RNA纯度及浓度，保存备用。

1.4 目的基因的扩增及重组质粒的构建

将病毒RNA反转录合成cDNA，用上、下游引物扩增目的片段。反应体系包括10×PCR缓冲液2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，Taq酶（25 U/μL）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 16.3 μL，共 25 μL。反应条件：95℃ 5 min，然后以 95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 2 min循环30次，72℃延伸10 min。将扩增产物送Invitrogen公司进行T7克隆，并测序。

1.5 测序结果比对

将测序结果与GenBank中的相应序列用DNA⁃Star的MegAlign和NCBI上的BLAST在线比对。

1.6 重组质粒的线性化及浓度测定

为了获得确定长度的含插入基因全长序列的转录产物，须将质粒线性化。76118、R22株重组质粒分别用SpeⅠ、SacⅠ内切酶于37℃消化3 h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察线性化结果。用SacⅠ内切酶线性化的R22株PCRⅡ质粒3'端突出，用T4DNA聚合酶修复，1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。用分光光度计测定线性化质粒含量。

1.7 体外转录及模板RNA标准品的制备

根据Riboprobe System-T7试剂盒说明进行体外转录。室温配制反应体系［5×磷酸盐缓冲液4 μL，二硫苏糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μL，核酸酶抑制剂（RNasin，40 U）1 μL，核糖核苷三磷酸（rNTP，终浓度各为 0.5 mmol/L）4 μL，线 性 化质粒 6 μL，T7RNA聚合酶（18 U）1 μL，无核酸酶的水2 μL，共20 μL］，37℃反应1 h；转录产物加1.5 μL脱氧核糖核酸酶（RQ 1 RNase Free DNase，1 U/μL），37℃继续反应20 min，除去DNA模板；然后用RNA纯化试剂盒纯化转录产物并用分光光度计测定含量。将已测浓度的体外转录RNA产物溶液浓度换算成拷贝/μL。拷贝数=浓度×阿伏伽德罗常数/（1个碱基对的平均分子质量×总长度），其中阿伏伽德罗常数为6.02×1023。

1.8 RT-PCR法鉴定体外转录RNA

将cRNA梯度稀释至1×1010～1×102拷贝/μL，以各稀释液为模板进行RT-PCR。汉坦病毒通用引物为 HANTAV1U（5'-CWGGVCARACAGCWGAYT-3'）和 HANTAV1L（5'-TCCWGGTGTAADYTCHTCWG C-3'）；探针为 HTN1P（5'-Fam-AGCATCATCGTCT ATCTTACATCC-Tamra-3'）和 SEO1P（5'-Fam-CTA TAATTGTCTATCTAACATCA-Tamra-3'）[5]。反应体系包括2×One Step RT-PCR缓冲液10 μL，Ex taq HS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix 0.4 μL，上 、下 游 引 物 各 0.4 μL，探 针 0.8 μL，ddH2O 5.6 μL，RNA 2 μL。 反 应 程 序 ：42℃ 5 min，95℃ 5 s；95℃ 15 s，52℃ 30 s，循环45次。

2 结果

2.1 76118、R22株S基因的扩增与重组质粒的确认

以反转录的cDNA为模板的扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，目的片段分别约为1.3和1.6 kb，与预期结果相符。以重组质粒为模板也扩增出相应大小的目的片段，表明获得了全长目的片段，且被克隆到PCRⅡ载体（图1）。

2.2 测序结果比对

将测序结果与GenBank中76118和R22株的S基因序列进行比对，结果显示，克隆的76118、R22株的S基因与相应标准株基因的序列一致性为99%，证实碱基序列正确，可用于后续体外转录等试验。

2.3 重组质粒线性化

76118、R22株重组质粒分别经SpeⅠ、SacⅠ内切酶酶切后得到线性化质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳，线性化质粒较环形质粒电泳慢，结果与预期相符，显示质粒线性化成功（图2）。

2.4 cRNA标准品的定量

经核酸蛋白测定仪测定，体外转录的76118、R22 株 cRNA 的质 量浓 度分 别 为 86.6 和 17.58 ng/μL，D260nm/D280nm值分别为 2.09 和 1.87，符合纯度要求。根据拷贝数换算公式，将转录产物分别梯度稀释至1×1010～1×102拷贝/μL的标准品。

图1 重组质粒的琼脂糖凝胶电泳1：76118株质粒扩增产物；2：R22株质粒扩增产物；M：250 bp DNA marker

2.5 RT-PCR鉴定cRNA标准品

以上述梯度稀释的 1×1010～1×102拷贝/μL 的cRNA为模板进行荧光定量PCR鉴定，结果显示76118和R22株的1×102拷贝/μL的标准品仍为阳性扩增（图3）。

3 讨论

图2 重组质粒线性化对比结果

图3 体外转录cRNA的RT-PCR扩增曲线A：76118株S基因体外转录cRNA的RT-PCR曲线；B：R22株S基因体外转录cRNA的RT-PCR曲线

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是重要的病毒性传染病。根据血清学研究，引起HFRS的汉坦病毒主要有HTN、SEO、PUU、DOB等血清型，在我国以HTN型和SEO型为主。而且，与布尼亚科其他属的病毒不同，汉坦病毒可以直接通过啮齿类的排泄物、呼吸分泌物等接触感染人[6]。该病为急性传染病，致死率较高，疫源区分布广泛，严重威胁人类的生命健康[7]。因此，建立模拟病毒RNA的标准品，对肾综合征出血热的早期诊断和治疗具有重要意义。

汉坦病毒基因组中S片段编码产物的保守性、抗原性和免疫原性较强，是主要的诊断抗原。我们以汉坦病毒S基因为研究对象，分别构建了HTN型76118株和SEO型R22株S片段全长含T7启动子的重组质粒，测序证实质粒构建成功；经T7RNA聚合酶进行体外转录，获得cRNA转录产物，可作为汉坦病毒的核酸扩增快速侦检技术方法的阳性标准品。

目前，常用的汉坦病毒检测方法有血清检测和基因检测，其中实时荧光定量PCR的灵敏性高，特异性好，操作简便，被广泛应用[8-10]。将特异性Taqman探针与目的基因特异性结合，在Taq酶的外切酶作用下将5'端标记荧光报告基团切下，发出荧光，大大提高了检测的灵敏性和特异性[11]。本研究利用探针荧光定量法对体外转录产物进行鉴定，经连续梯度稀释，含量换算成拷贝数为1×1010～1×102拷贝/μL的标准品，进行荧光定量PCR扩增。相对于质粒DNA的检测，cRNA一步法检测将RNA的反转录和PCR扩增一次性完成，避免了对环境的污染和反转录过程中的操作误差，而且操作步骤减少可大大降低样本RNA的降解，提高检测结果的重复性和稳定性。

我们通过基因克隆和体外转录获得含汉坦病毒S全长基因的cRNA产物，为建立和优化汉坦病毒快速检测提供了阳性定量标准品，也为后续开展汉坦病毒的基因功能、疫苗等研究奠定了基础。

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