不同产地与规格半夏中4种核苷(或碱基)的含量测定及统计分析

阮洪根，何禄仁，宋平顺，赵建邦，丁永辉

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000； 甘肃省食品药品检验所·甘肃省中药品质与安全工程技术研究中心，甘肃 兰州 730000； 甘肃省食品药品监督管理局，甘肃 兰州 730000)

半夏为天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥块茎[1]，具有镇咳、抗心律失常、抗肿瘤、解毒抗炎的作用，临床药理作用广泛[2]。吴皓等[3]从半夏水溶性成分中分离到肌苷认为是其指标成分，也是半夏药材的鉴别成分。也有学者在半夏的水提液中检测到尿苷[4]。除肌苷、尿苷外，从半夏中还检测到尿嘧啶、黄嘌呤。核苷类成分参与DNA代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性[5]。20世纪90年代，国内开始有对半夏药材中核苷类成分的报道，多采用高效液相色谱(HPLC)法[6]。本研究中，对半夏药材中尿嘧啶(碱基)、黄嘌呤(碱基衍生物)、尿苷和肌苷(次黄嘌呤核苷)进行了含量测定，并对数据进行充分分析、比较，旨在对半夏的质量控制指标作进一步认识。现报道如下。

1 仪器与试药

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括2695-2998PDA型检测器；万分之一电子分析天平，Mettle-AE163型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler公司)；H1650型离心机(长沙湘仪)；超声波清洗器(昆山仪器厂)；旋转蒸发仪，定量分析滤纸。尿嘧啶(批号为100469-200401)、黄嘌呤(批号为 140662-200301)、尿苷(批号为 887-200202)、肌苷(批号为140669-201104)对照品均购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于99.5%；蒸馏水。半夏药材的采集地为甘肃天水、武都、西和、徽县以及云南、贵州、江西、湖北等地，药材经甘肃省食品药品检验所宋平顺主任药师鉴定为天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥块茎。半夏药材均干燥、粉碎、过4号筛，备用。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取尿嘧啶4.48 mg、黄嘌呤8.94 mg、尿苷6.65 mg、肌苷4.07 mg，分别定容于50 mL容量瓶中，得对照品贮备液；分别依次吸取上述对照品贮备液2，3，3，2 mL混合于10 mL容量瓶中，得混合对照品贮备液。称取半夏药材1.5 g，精密称定，置磨口具塞锥形瓶中，分别加水20 mL和15 mL，超声提取2次，每次30 min，于3 000 r/min离心10 min，抽滤，合并滤液，滤液浓缩，定容至10 mL，于3 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件[7]及系统适用性试验

色谱柱:Kromasil100-5C18E51072色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相:水；流速0.8mL/min；柱温:30℃；测定波长:254 nm；进样量:10μL。在此条件下，色谱图见图1。尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷的保留时间依次是4.8，8.6，10.6，26.0min，理论塔板数以尿嘧啶计不低于8000，分离度优良。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密吸取混合对照品贮备液5 mL和2 mL分别置10 mL容量瓶中，1 mL置25 mL容量瓶中，1 mL置100 mL容量瓶中；加水稀释至刻度，摇匀，连同原贮备液制得标准曲线对照品溶液系列。分别进样4次，以对照品溶液的质量浓度(C)为横坐标、峰面积平均值(Y)为纵坐标进行线性回归，求得4个组分的回归方程。结果见表1。

精密度试验:称取半夏药材(甘肃徽县)1.5 g，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，进样6次。结果尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷峰面积的 RSD依次为0.89%，1.21%，1.32%，1.53%(n=6)。

重复性试验:称取半夏药材(甘肃徽县)1.5 g，精密称定，共6份，按2.1项下方法制备供试品溶液，依法进样测定含量。结果尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷含量的 RSD依次为2.36%，2.23%，1.95%，2.44%(n=6)。

图1 高效液相色谱图

表1 线性关系考察结果

加样回收试验:称取半夏药材(甘肃徽县)0.75 g，精密称定，用移液器精密加入0.15 mL尿苷、0.05 mL黄嘌呤、0.50 mL尿苷、0.20 mL肌苷对照品贮备液，分别加水19.1 mL和15 mL，按2.1项下供试品溶液制备方法制备待测溶液，依法进样测定核苷(或碱基)含量，计算回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定与分析

甘肃不同产地及甘肃省外半夏药材:称取甘肃不同产地及甘肃省外半夏药材样品1.5 g，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，依法进样测定核苷(或碱基)含量，结果见表3。样品聚类分析结果见图2。

不同规格半夏药材:称取3个产地的不同规格(大粒、中粒、小粒)的半夏药材，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，依法进样测定含量。结果见表4。

样品嵌套设计资料方差分析:结果见表5和表6。

3 讨论

制备供试品溶液时，样品提取过程中，采用超声后离心、上清液再抽滤的方法，提取效果好。若直接抽滤，滤液下滴速度慢、难度大，基本上无法操作。

聚类分析结果显示，编号为1，2，3，4，5，6，8 号的样品聚为一类，7，9，10，11，12，13 号的样品聚为另一类。1，2，3，4，5，6，8 号样品均为甘肃省内样品，10，11，12，13号样品为省外样品。7号为引种品种，与省外聚合为一类，可见引种与省外样品的来源一致。9号样品不知来源，但从其与省外样品合并为一类，可初步判定其也为引种品。因此，甘肃省与省外的半夏品种可很好地区分，显示出其道地性。

嵌套设计资料的方差结果显示，模型检验Corrected Model的F=14.727，P=0.000，所统计的数据有统计学意义；因素规格的统计量 F=0.292，P=0.749＞0.01，说明不同规格样品间核苷(碱基)含量的差异无统计学意义，说明半夏大粒、中粒、小粒间质量无明显差异，故规格不能作为评判半夏质量的指标。因素产地的统计量 F=39.348，P=0.000＜0.01，说明不同产地样品间核苷(碱基)含量的差异有统计学意义，可进一步作多重比较。由LSD法多重比较结果可知，产地1(甘肃永靖)样品的核苷含量最高，优于产地2(贵州)样品和产地3(云南)样品；产地2和产地3比较，P=0.686＞0.01，差异无统计学意义。

表2 加样回收试验结果(n=6)

表3 甘肃不同产地及甘肃省外半夏中核苷(或碱基)含量测定结果(n=4)

图2 样品聚类分析图

表4 不同规格半夏药材中核苷(或碱基)含量测定结果(n=4)

表5 主体间效应的检验表

表6 LSD法多重比较表

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:110-113.

[2]徐 萍，张学兰，吴畅灏.半夏的研究进展[J].中国药业，2003，12(3):76.

[3]吴 皓，李 伟，张科卫，等.半夏药材鉴别成分的研究[J].中国中药杂志，2003，28(9):836.

[4]Chen P，Li C，Liang S，et al.Characterization and quantification of eight water-soluble constituents in tuber of Pinellia ternata and in tea granules from the Chinese multiherb remedy Xiaochaihutang[J].J Chromatogr B，2006，843(2):183-193.

[5]Kinahan JJ，Kowal EP，Grindey GB.Biochemical and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosylcy tosine against eukemia L1210[J].Cancer Res，1981，41(2):445.

[6]葛秀允，吴 皓.半夏的化学成分及质量评价方法[J].中国药业，2009，18(9):4.

[7]吕爱娟，张志澄，张科卫，等.RP-HPLC法同时测定半夏中5种核苷含量的研究[J].药物分析杂志，2007，27(7):1 051.