山楂酸保护顺铂致人肾小管上皮细胞氧化应激损伤作用机制研究

欧阳资章,朱少华,邬淑红,陈 方,刘晓萍,肖诚胤

(1.清远市人民医院,广东 清远 511515;2.中山大学 药学院,广东 广州 510006;3.清远市妇幼保健院,广东 清远 511500)



山楂酸保护顺铂致人肾小管上皮细胞氧化应激损伤作用机制研究

欧阳资章1,朱少华2,邬淑红3,陈 方1,刘晓萍1,肖诚胤1

(1.清远市人民医院,广东 清远 511515;2.中山大学 药学院,广东 广州 510006;3.清远市妇幼保健院,广东 清远 511500)

目的：研究山楂酸对顺铂(cisplatin)致近段人肾小管上皮细胞(HK-2)氧化应激损伤的保护作用机制。方法：实验共分四组：空白组、顺铂组、山楂酸保护组、维生素E保护组；培养HK-2细胞，加入顺铂及预先加入山楂酸或维生素E进行孵育，采用试剂盒测定细胞内MDA及GSH含量，采用荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内ROS含量，采用流式细胞术测定细胞凋亡及坏死情况。结果：经山楂酸干预后，HK-2细胞内MDA明显减少，GSH明显增加，表明山楂酸能显著抑制顺铂诱导的细胞内ROS水平升高；流式细胞术测定结果表明山楂酸对顺铂所致的细胞毒性有保护作用。结论：山楂酸对顺铂诱导的HK-2氧化应激损伤具有保护作用。

山楂酸；顺铂；活性氧；作用机制

顺铂是目前临床常用的有效化疗药物，广泛用于各种实体瘤的治疗，但剂量依赖性的肾毒性副作用也极大地限制其应用[1]。因此，如何有效防治顺铂的肾毒性是抗肿瘤化疗过程中亟待解决的问题。研究[2-3]表明，氧化应激损伤可能是导致顺铂肾毒性的重要原因，表现为顺铂可引起脂质过氧化产物含量增多、抗氧化酶活性下降等。山楂酸是一种五环三萜酸，存在于山楂，红枣等多种植物，研究表明山楂酸具有多种药理活性，如抗癌[4]、抗氧化[5-6]、抗艾滋病[7]、抗菌[8]、抗2型糖尿病[9]等作用。前期研究发现山楂酸对顺铂所致的大鼠肾毒性具有保护作用，且细胞实验结果表明山楂酸对顺铂所致的细胞毒性有保护作用。因此，本研究选用人肾小管上皮细胞，研究山楂酸对顺铂所致氧化损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

山楂酸(长沙雅莹生物科技有限公司)，顺铂(南京建成生物工程研究所)，维生素E(中国食品药品检定研究院)，人近段肾小管上皮细胞HK-2(由中山大学动物实验中心细胞库提供)；GSH试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，DMEM干粉培养基(美国 Invitrogen 公司)，DCFH.DA-ROS检测试剂盒(杭州碧云天公司)；胎牛血清 (Hyclone)，其它试剂为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞内谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量检测 取对数生长期的HK-2细胞，以细胞数5×104/孔接种于6孔板中，培养24h 后，换无血清培养基同步化12h。采用“MTT 检测细胞存活率”处理，离心 (1000r·min-1，5min)收集上清液中的漂浮细胞，贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集。各组细胞用4℃预冷的PBS离心洗涤2次，加生理盐水300μL进行超声破碎，离心收集上清液。按照GSH检测试剂盒说明书，取上清液250μL进行去蛋白处理，离心后取上清液进行显色反应。反应结束后将反应液加入到 96 孔板中，用酶标仪检测405nm处的吸收度并计算 GSH 含量。同样收集上清液，用MDA试剂盒检测MDA含量活性。以上实验均重复3 次。

1.2.2 细胞内活性氧( ROS)含量检测 取对数生长期的HK-2细胞，以细胞数1×104/mL (200μL/孔) 接种于96孔黑色接种板，置于5%CO2、37℃培养箱培养24h，更换5%血清培养基，加入山楂酸或维生素E预孵育2h，除尽培养基；参照碧云天公司的活性氧检测试剂盒说明书，装载DCFH-DA探针，37℃培养箱孵育20 min，用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，再加入顺铂(30μmol·L-1)孵育2h，用多功能酶标仪检测，激发波长为488nm、发射波长525nm。以上实验均重复 3次。

1.2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡和坏死 细胞以5×105cells/mL密度种板于6孔板，24h后弃除培养基，换无血清培养基，12h后弃除无血清培养基，换新的无血清培养基，相应组给予2-DG、Nec-1或z-VAD-fmk，30min给予CsA，继续培养24h，结束培养时用不含EDTA的消化液消化细胞，于流式细胞仪测定。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 山楂酸对顺铂所致细胞内GSH减少的影响

给予顺铂作用12h，细胞内GSH减少，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；先给予山楂酸、维生素E，再给予顺铂，细胞内GSH相对于单独CsA组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 山楂酸对顺铂所致细胞内谷胱甘肽(GSH)减少的影响

注：与对照组比较，*P< 0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

2.2 山楂酸对顺铂所致细胞内MDA的影响

给予顺铂作用12h，细胞内MDA增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；预先给予山楂酸、维生素E，再给予CsA，细胞内MDA相对于单独CsA组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 山楂酸对顺铂所致细胞内丙二醛(MDA)的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

2.3 山楂酸对顺铂所致细胞内ROS的影响

CsA作用12h，引起细胞内ROS急剧增加，山楂酸能够抑制CsA所致ROS增加；维生素E作为ROS清除剂，能降低CsA作用后细胞内ROS含量，山楂酸作用接近维生素E。见图3。

图3 山楂酸对顺铂所致细胞内活性氧簇(ROS)的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

2.4 流式细胞仪测定凋亡和坏死结果

顺铂能引起细胞凋亡以及坏死，而山楂酸与维生素E均能减少顺铂所致的细胞凋亡和坏死，且山楂酸作用与维生素E作用相当。见图4。

图4 流式细胞术法测定山楂酸对顺铂所致肾小管上皮细胞凋亡和坏死的影响

3 讨论

肾脏作为顺铂在体内的主要排泄器官，且肾脏也是顺铂的主要毒性靶器官，其肾毒性极大限制了顺铂的临床应用[10]。有文献[11-13]报道，顺铂诱发的肾毒性与氧化应激产生的氧化损伤密切相关。顺铂可导致肾小管上皮细胞产生大量氧化自由基基，同时还可抑制细胞内抗氧化酶(GSH、MOD、GST等)系统。据研究[14-15]表明，一些天然抗氧化成分能在一定程度上减轻顺铂的细胞毒性。

山楂酸为植物提取的天然成分，MONTILLA等[16]发现山楂酸能抑制由氧自由基引起的肝细胞膜中脂质过氧化。因此，山楂酸可用于抵抗生物体内的氧化应激作用，避免细胞受到损伤。

前期研究采用动物实验探讨山楂酸对顺铂所致大鼠肾毒性的保护作用，结果显示，山楂酸对顺铂的肾毒性具有保护作用[17]。因此，本研究运用人近段肾小管上皮细胞为模型细胞，研究山楂酸对顺铂诱导人肾小管上皮细胞氧化应激损伤的保护作用机制。本研究选择HK-2细胞作为体外氧化损伤细胞模型，测定细胞内抗氧化酶GSH含量及体内氧化应激指标MDA水平，同时运用DCFH-DA探针测定细胞内ROS水平，结果显示山楂酸可确切降低顺铂诱导的细胞内ROS水平，增加抗氧化酶GSH含量。采用流式细胞术再次研究山楂酸对顺铂所致细胞凋亡及坏死的保护作用，结果显示山楂酸对顺铂所致的细胞毒性有保护作用。

综上所述，山楂酸可减轻顺铂氧化应激损伤，但其具体保护机制如所涉及的信号通路等有待进一步研究。

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(责任编辑：李岚春)

2014-08-13

欧阳资章(1973-)，男,博士，广东省清远市人民医院副主任药师，研究方向为药物毒理学。

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1673-2197(2014)24-0009-03