羽衣甘蓝中多酚的提取与抗氧化活性研究

林格西,吴圣迁,江俊妮,王梦婵,陈 功,蓝星宇,李向荣

(浙江大学城市学院 医学院 药学系，浙江 杭州 310015)



羽衣甘蓝中多酚的提取与抗氧化活性研究

林格西,吴圣迁,江俊妮,王梦婵,陈 功,蓝星宇,李向荣*

(浙江大学城市学院 医学院 药学系，浙江 杭州 310015)

目的：优化羽衣甘蓝中多酚成分的提取工艺，确定羽衣甘蓝最佳提取条件,研究多酚对三种自由基的清除率，进一步分析羽衣甘蓝中多酚的抗氧化活性。方法：多酚提取主要采用超声波提取方法，并通过正交试验确定优化提取条件，采用邻苯三酚自氧化法、Fenton反应、DPPH法检测其清除自由基。结果：羽衣甘蓝优化提取条件为：料液比1∶20,乙醇浓度为50%，提取时间40min，温度40℃。根据该条件提取总多酚，提取率为6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。对多酚总抗氧化活性能力进行研究，其抗氧化特性较好。结论：采用正交实验优化羽衣甘蓝最佳提取条件，提取出的多酚成分对人体自由基清除作用良好，并具有较好的抗氧化活性。

羽衣甘蓝；多酚；提取；抗氧化活性

植物多酚具有多种保健功能，其中最重要的是抗氧化功能。药材羽衣甘蓝中多酚成分对活性氧自由基具有较强的捕捉能力，且可对由氧自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，具有明显的抗突变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能。因此，植物多酚在医药、食品、保健品、化妆品等行业具有巨大的应用前景和价值，而羽衣甘蓝的抗氧化活性研究未见文献报道。由羽衣甘蓝提取多酚并进行抗氧化活性研究，对天然蔬菜食品和综合利用农资具有良好的经济效益[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 羽衣甘蓝；无水乙醇：分析纯，太仓新太酒精有限公司；无水碳酸钠(太仓美达试剂有限公司)，分析纯；福林酚试剂(上海泽衡生物技术有限公司)；没食子酸对照品；DPPH(纯度98.0%，美国SIGMA公司)；无水乙醇(中国杭州化学试剂有限公司)，纯度99.7%；维生素C(中国杭州化学试剂有限公司)，纯度99.7%；其它试剂为分析纯。

1.1.2 仪器 超声仪(KQ-700DB型控数超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司)；紫外可见分光光度计7200型(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，JY6001型；纯水仪(MILIPORE净水系统)；分析天平：梅特勒-托利分析天平(METTLER TOLEDOXS105,d=0.01mg)；真空泵：循环水式多用真空泵SHB-IIIA(河南省太康科教器材厂)；电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240A型(上海精宏实验设备有限公司)；恒温水浴锅HH4(国华电器有限公司)；PH计：PHS-C3型(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 多酚的提取 称取一定量羽衣甘蓝，洗净，切成碎片，置于50℃烘箱中烘干，烘干后研磨成粉末状，并封装于真空干燥器内备用；称取0.8g羽衣甘蓝粉末，在正交设定条件下采用超声方法提取，提取液用真空抽滤泵抽滤，低温保存[2]。

1.2.2 正交实验 提取条件：乙醇浓度、提取时间、料液比、温度四个因素，每因素设定三个水平，进行三水平四因素的正交实验，按L9(34)正交表的实验设计，提取2次，合并提取液，测定提取液中多酚含量[3]。

表1 正交实验水平因素

1.2.3 多酚含量测定 ①没食子酸标准曲线绘制。精密量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL质量浓度为0.1mg·mL-1的没食子酸标准溶液于5mL容量瓶中，加入1mL福林酚试剂，充分震荡后静置2～3min；各容量瓶均加入浓度为20% 的Na2CO3溶液2mL,摇匀，加入蒸馏水定容至刻度，置于25℃恒温水浴锅反应1h；于波长765nm处测定吸光度值，同时做空白实验。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，并采用二元线性回归法回归线性方程。

②总酚含量测定。精密量取1mL羽衣甘蓝提取液，分别加入1mL福林酚试剂和2mL Na2CO3溶液，摇匀，加入蒸馏水定容至刻度，置于25℃恒温水浴锅中水浴反应1h；于波长765nm处测定吸光度值，同时做空白实验。测得的吸光度根据标准曲线方程可测得羽衣甘蓝中多酚成分的含量。

1.2.4 抗氧化活性的测定 ①对DPPH自由基的清除。称取2,2-二苯代苦味酰基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)标准品20mg，无水乙醇定容至500mL，即得质量浓度0.04mg·ml-1溶液。取溶液2mL，加入不同浓度样品液2mL，室温反应30min，于517nm波长处测定吸光度，空白组以2mL无水乙醇代替样品液，测试3组，采用Vc做对照, 计算清除率，公式为[4]：

DPPH 自由基清除率(E) =(1-A样/A空)×100%

②对羟自由基的清除。 设置三种试管，未损伤管中加入2mL磷酸缓冲液(pH为7.4)和1mL邻二氮菲(浓度为0.75mmol·L-1),混匀后加入0.75mmol·ml-1硫酸亚铁溶液1mL，再加入蒸馏水1.5mL。损伤管以1mL浓度为0.01%的过氧化氢溶液代替，样品管则加入0.5mL溶液，不同浓度样品液以蒸馏水代替。所有试管均于37℃水浴反应1h，于波长537nm处分别测得吸光度。测试3组，采用Vc做对照，计算清除率，公式为[5]：

清除率= (A样-A损/A未损-A损)×100%

③对超氧阴离子自由基的清除。 精密量取4.5mL浓度为50mmol·L-1的Tris-HCl缓冲溶液( pH为8.2 )于试管中，加入1mL不同浓度样品液，于25℃水浴反应20min，加入25℃水浴预热的3mmol·L-1邻苯三酚0.3mL，在325nm波长下测定吸光度，且每隔30s测定1次，联系测定4min，以蒸馏水做空白对照。测试3组，并用Vc作对照，计算羽衣甘蓝清除率，公式为[6]：

清除率= (△Ao-△A1/△Ao) ×100%

式中：Ao—空白组吸光度；A1—样品吸光度。

④总抗氧化能力测定。 在2.5mL磷酸盐缓冲液(pH为6.6)中加入不同浓度的样品溶液2.5mL及1%的铁氰化钾溶液2.5mL；混合物在50℃恒温20min，加入浓度为10%的三氯乙酸溶液2.5mL，取5mL溶液加蒸馏水5mL和0.1%的FeCl3溶液1mL，于700nm处测定吸光度。采用蒸馏水作为无还原能力对照(调仪器零点)，测试3组，以Vc作为对照组。

2 结果

2.1 没食子酸标准曲线

没食子酸质量浓度分别为0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03mg·mL-1，吸光度分别为0.362、0.43、0.534、0.601、0.686、0.771。根据测得结果，可绘制没食子酸的标准曲线，标准方程为：Y=164.57X+0.276，R2=0.997 7。见图1。

图1 没食子酸的标准曲线

2.2 正交实验结果

以提取溶剂乙醇浓度(体积分数)、料液比、提取温度、提取时间为考察因素，进行三水平四因素正交实验，以确定最佳提取条件。结果见表1。

表1 羽衣甘蓝多酚提取正交试验结果

根据实验数据分析可知，乙醇浓度、温度、提取时间、料液比均对羽衣甘蓝多酚成分提取率造成影响，其优化最佳提取条件为A3B2C2D2，即乙醇浓度为50%，提取时间40min，温度40℃，料液比为1∶20，可在此优化提取条件提取多酚。最优提取工艺提取羽衣甘蓝多酚质量浓度为0.32mg·mL-1，提取率为6.4mg·g-1，其中料液比对多酚的提取影响显著。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 羟自由基清除能力 羽衣甘蓝对羟自由基的清除能力较抗坏血酸强，随着多酚浓度的增加呈上升趋势。见图2。

图2 多酚对羟自由基清除能力

2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力 采用邻苯三酚自氧化法测定羽衣甘蓝中多酚对超氧阴离子自由基的清除能力。邻苯三酚在碱性条件下可发生自氧化反应，产生浓度稳定的超氧阴离子自由基与中间物，中间物可与超氧阴离子自由基反应，得到一种具有颜色反应的中间产物，对紫外线具有一定的吸收能力，引起某波长处吸光值的线性积累，从而反映抗氧化剂清除能力的大小。

羽衣甘蓝中多酚对超氧阴离子自由基清除能力较抗坏血酸弱，随多酚浓度的增加呈上升趋势。实验结果见图3。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH属于有机溶剂中一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，氮原子有1个孤对电子，呈紫色，于517nm处吸收较强。当自由基清除剂存在时，DPPH单电子被配对会使颜色变浅，在最大吸收波长处吸光度变小，且颜色变浅程度与配对电子数成化学剂量关系，因此可用于检测自由基的清除能力，从而评价实验样品的抗氧化活性。

多酚对DPPH自由基清除能力较Vc不明显，且随着多酚质量浓度增加清除能力呈上升趋势。实验结果见图4。

图4 多酚对DPPH自由基清除能力

2.3.4 总抗氧化能力的测定 羽衣甘蓝的总抗氧化能力较Vc不明显，抗氧化能力较弱，且随着多酚质量浓度升高能力增强。结果见图5。

图5 多酚总抗氧化能力

3 讨论

植物多酚来源较为广泛，且安全无毒，并有一定的营养和保健功效，相关研究一直是国内外研究的热点。本实验结果表明羽衣甘蓝中多酚成分对DPPH 、超氧阴离子和羟自由基均具有较强的清除效果，且抗氧化能力较好，可为羽衣甘蓝进一步应用提供理论依据。羽衣甘蓝优化提取条件为：料液比1∶20,乙醇浓度为50%，提取时间40min，温度40℃。根据该条件提取总多酚，提取率为6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。对多酚总抗氧化活性能力进行研究，其抗氧化特性较好。

综上所述，采用正交实验优化羽衣甘蓝最佳提取条件，提取的多酚成分对人体自由基清除作用良好，并具有良好的抗氧化活性。本实验初步探讨羽衣甘蓝多酚的提取工艺与抗氧化活性，关于多酚的分离纯化及生物活性有效具体成分尚待进一步研究。

[1] 赵晓云,赵博,邢媛媛,等.荷叶多酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].中国酿造,2010(3):79-83.

[2] 樊素芳,王彩霞,徐翠莲,等.山药总多酚的提取工艺优化[J].安徽农业科学,2010(33): 18770-18772.

[3] 李焘,屈新运,王喆之.菘蓝种子总多酚提取工艺的优化及抗氧化活性研究[J].中成药, 2011(11): 12.

[4] 刘佳,焦士蓉,唐远谋,等.苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性[J].食品科学,2011,32(14): 134-138.

[5] 孙瑾,王宗举,陈岗,等.橄榄中多酚类物质体外抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂, 2010(3):69-7.

(责任编辑：李岚春)

2014-08-27

浙江大学城市学院大学生科研基金(9x2013562114)

林格西，女，浙江大学城市学院在读生，研究方向为药学。

李向荣，男，浙江大学城市学院教授，硕士生导师，研究方向为天然产物药效物质的分离纯化及药效学。E-mail:lixr@zucc.edu.cn

R284.2;TQ461

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1673-2197(2014)24-0014-03