合成红景天苷对H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用研究*

肖露，王静，朱凌鹏，王秋娟，颜天华**，王彦，曹永兵

1中国药科大学生理教研室，南京 210009；2中国人民解放军第二军医大学，上海 200433

合成红景天苷对H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用研究*

肖露1，王静1，朱凌鹏1，王秋娟1，颜天华1**，王彦2，曹永兵2

1中国药科大学生理教研室，南京 210009；2中国人民解放军第二军医大学，上海 200433

目的：研究合成红景天苷对过氧化氢所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：体外培养H9c2细胞，分为正常对照组、模型组、提取红景天苷（10-4mol·L-1）组和合成红景天苷（10-6、10-5、10-4mol·L-1）组，药物孵育24 h后，加入过氧化氢终浓度400 μmol·L-1损伤4 h，检测各组细胞活力和培养液上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。结果：与正常对照组相比，模型组细胞活力、SOD活性显著降低，LDH、CK活性和MDA含量显著升高（P<0.01）。与模型组相比，红景天苷预处理组能明显提高细胞活力和SOD活性（P<0.05），明显降低LDH、CK活性及MDA含量（P<0.05），并与浓度呈正相关。结论：红景天苷对过氧化氢造成的心肌细胞氧化应激损伤有明显的保护作用，且合成红景天苷效果优于提取红景天苷。

合成红景天苷；提取红景天苷；过氧化氢；氧化损伤；H9c2细胞

氧化应激是指机体活细胞内氧自由基的产生和消除失衡，或者外源性氧化物质摄入过量，导致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）过量蓄积，引起细胞毒性改变，是心肌缺血损伤的重要原因之一[1-2]。红景天苷（Sal）是藏药红景天中的主要有效成分，近年来研究证明，红景天苷具有保护心脑血管系统、调节免疫系统、防辐射、抗疲劳、抗肿瘤等多种药理作用[3]。尤其在心血管方面红景天苷具有抗心肌缺血、减小心肌梗死面积、抑制心肌细胞凋亡、保护心肌等作用[4]。红景天苷因其具有突出的药理作用，极具开发前景，但由于环境恶化和人为过度采挖，野生红景天的数量迅速减少[5]，所以从20世纪70年代至今，药物及有机化学工作者在红景天苷的合成及结构改造方面做了大量的研究工作[6]，目前已经成功合成出红景天苷单体，但其药理活性与天然提取红景天苷有无差异，目前仍不清楚。本实验以体外培养H9c2细胞为基础，以过氧化氢（H2O2）造成氧化应激损伤为模型，通过检测细胞活力，培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的变化，研究合成红景天苷对氧化应激损伤的H9c2心肌细胞的保护作用及其相关机制，并探讨合成红景天苷是否优于提取红景天苷，为开发具有临床使用价值的抗心肌缺血新药提供理论依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

CO2培养箱（Thermo）；XD-202倒置显微镜（江南仪器厂）；超净工作台（Boxun）；BS110S电子分析天平（Sartorius），离心机（湘仪）；680型酶联免疫检测仪（上海众生声明科学发展有限公司）；TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试剂与药品

合成红景天苷（由第二军医大学合成并提供，纯度＞99%，用时以无血清DMEM高糖培养基配成相应浓度，过滤）；提取红景天苷（西安开来生物工程有限公司，纯度＞98%，配制方法同上）；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（南京生兴生物技术有限公司）；过氧化氢（南京化学试剂有限公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，碧云天生物技术公司）；LDH、CK、MDA、SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究院）。

1.3 细胞株

H9c2细胞株：购自江阴康众康明生物医药技术有限公司。

2 方法

2.1 H9c2心肌细胞培养

DMEM高糖培养基，10%胎牛血清，100 U·μL-1青霉素和100 μg·μL-1链霉素的培养液，37℃、5% CO2条件下培养。待细胞长到培养瓶的80%～90%，用0.25%胰酶消化2～3 min，加入含有血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞培养瓶壁制成细胞悬液，一周传代2～3次。

2.2 红景天苷对正常H9c2细胞的影响

选择对数生长期的细胞，用胰酶消化制成细胞悬液，按每孔1×104个细胞[7]均匀加入96孔板中培养，每孔160 μL，24 h后，随机分5组，每组设6个复孔：除正常对照组加入20 μL的无血清DMEM高糖培养基外，还有4个给药组分别加入相应浓度等体积Sal药液，使药物终浓度分别为10-4mol·L-1（Ext Sal），10-6、10-5、10-4mol·L-1（Syn Sal），24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg·mL-1），使其终浓度为0.5 mg·mL-1，于37℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入200 μL的DMSO，室温摇床10 min，于490 nm处用酶标仪测定每孔吸光度值。

2.3 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的影响

2.3.1 H9c2心肌细胞氧化应激模型的建立选择对数生长期的细胞，用胰酶消化制成细胞悬液，按每孔1×104个细胞[7]均匀加入96孔板中，每孔160 μL，培养48 h后用于试验。H2O2用PBS稀释后制备成500、1000、2000、4000、8000 μmol·L-1梯度浓度的处理液，除空白对照组加入20 μL的PBS外，其余7组分别加入相应浓度的H2O2处理液20 μL，使得过氧化氢各梯度组的终浓度分别为50、100、200、400、800 μmol·L-1。37℃孵育4 h后，根据MTT法检测的细胞活力选择最佳H2O2干预浓度。

2.3.2 实验分组与处理选择对数生长期的细胞，用胰酶消化制成细胞悬液，按每孔1×104个细胞[7]均匀加入96孔板中培养，每孔160 μL，24 h后，细胞用于试验。实验分为：正常对照组、模型组、10-4mol· L-1Ext Sal组和10-6、10-5、10-4mol·L-1Syn Sal组。正常对照组和模型组加入20 μL的无血清DMEM高糖培养基，给药组加入相应浓度的Sal药液20 μL，使其终浓度分别为10-4mol·L-1（Ext Sal），10-6、10-5、10-4mol·L-1（Syn Sal），药物孵育24 h后，除空白对照组加入20 μL的PBS外，其余各组均加入20 μL的4000 μmol·L-1H2O2处理液，终浓度为400 μmol·L-1，损伤4 h后，即加入Sal后共培养28 h，终止实验。

2.3.3 细胞活力的测定选择对数生长期的细胞，用胰酶消化制成细胞悬液，按每孔1×104个细胞均匀加入96孔板中培养，每孔160 μL，24 h后，随机分6组，每组设6个复孔，正常对照组和模型组加入20 μL的无血清DMEM高糖培养基，各给药组加入相应浓度等体积的药液，使药物终浓度分别为10-4mol·L-1（Ext Sal），10-6、10-5、10-4mol·L-1（Syn Sal），24小时后，正常对照组加入20 μL的PBS，模型组和各给药组均加入20 μL的4000 μmol·L-1H2O2处理液，使其终浓度为400 μmol·L-1，于37℃作用4 h后，MTT法测定细胞活力。

2.3.4 LDH、CK、SOD活性和MDA含量检测实验终止后，取各实验组的细胞培养液上清液，分别按照LDH、CK、SOD和MDA试剂盒说明书操作，检测各组的LDH、CK、SOD活性和MDA含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 红景天苷对正常H9c2心肌细胞的影响

各组细胞加药孵育24 h后，与正常对照组比较，红景天苷各浓度对正常H9c2细胞无明显影响。结果见表1。

表1 红景天苷对正常H9c2心肌细胞活力的影响（±s，n=6）

表1 红景天苷对正常H9c2心肌细胞活力的影响（±s，n=6）

组别浓度（mol·L-1）OD（A 490 nm）正常对照-0.615±0.032Ext Sal10-40.598±0.064Syn Sal10-60.581±0.07410-50.594±0.04110-40.603±0.054

3.2 不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞氧化应激损伤细胞活力的影响

50、100、200、400、800 μmol·L-1的H2O2处理H9c2心肌细胞4 h均能降低细胞活力，且随着H2O2浓度升高，细胞活力逐渐降低。结果表明，800 μmol· L-1的H2O2处理细胞时，细胞活力为37%，400 μmol·L-1的H2O2处理细胞时，细胞活力为50%，提示该浓度可以兼顾体现H2O2的氧化应激损伤和适当的细胞活力，故选取400 μmol·L-1为后续试验的H2O2浓度。不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞氧化应激损伤细胞活力的影响见表2。

表2 不同浓度H2O2对H9c2细胞氧化应激损伤细胞活力的影响（±s，n=6）

表2 不同浓度H2O2对H9c2细胞氧化应激损伤细胞活力的影响（±s，n=6）

注：与正常对照组比较：##P<0.01

组别浓度（μmol·L-1）OD值存活率（%）正常对照-0.618±0.027100过氧化氢500.592±0.03395.81000.568±0.03891.92000.406±0.048##65.54000.310±0.021##50.2 8000.231±0.025##37.4

3.3 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的影响

3.3.1 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞活力的影响与正常对照组比较，模型组细胞活力显著下降（P<0.01）；而与模型组比较，红景天苷中、高浓度组对H2O2诱导的细胞活力下降有明显改善（P< 0.01），结果见表3。

表3 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞活力的影响（±s，n=6）

表3 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞活力的影响（±s，n=6）

注：与正常对照组比较：##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

组别浓度（mol·L-1）OD（A 490 nm）正常对照-0.623±0.048模型对照-0.357±0.032##Ext Sal10-40.586±0.052**Syn Sal10-60.408±0.02610-50.531±0.039**10-40.604±0.053**

3.3.2 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞LDH和CK的影响与正常对照组比较，模型组LDH和CK活力显著升高（P<0.01）；与模型组比较，红景天苷中、高浓度组LDH和CK活力显著降低（P< 0.01），结果见表4。

表4 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞LDH和CK的影响（±s，n=6）

表4 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞LDH和CK的影响（±s，n=6）

注：与正常对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：**P<0.01

组别浓度（mol·L-1）LDH（U·L-1）CK（U·mL-1）正常对照-89.38±8.560.97±0.09模型对照-173.63±20.43##1.84±0.12##Ext Sal10-4135.47±14.61**1.18±0.23**Syn Sal10-6163.37±14.851.75±0.1110-5137.18±15.72**1.33±0.11**10-4121.79±13.07**1.05±0.10**

3.3.3 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞MDA和SOD的影响与正常对照组相比，模型组MDA含量显著升高（P<0.01），SOD活力显著下降（P< 0.01）；与模型组比较，红景天苷中、高浓度组MDA含量显著降低（P<0.01），SOD活力显著升高（P< 0.01），结果见表5。

表5 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞MDA和SOD的影响（±s，n=6）

表5 红景天苷对H2O2诱导的H9c2细胞MDA和SOD的影响（±s，n=6）

注：与正常对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

组别浓度（mol·L-1）MDA（nmol·mL-1）SOD（U·mL-1）正常对照-1.23±0.1414.21±1.20模型对照-2.24±0.32##8.06±1.42##Ext Sal10-41.75±0.18**11.06±1.24**Syn Sal10-62.08±0.268.43±0.8710-51.83±0.19*10.24±0.95*10-41.62±0.21**12.33±1.13**

4 讨论

H9c2心肌细胞培养作为一种体外研究模型，已成为从分子细胞水平研究心血管疾病发病机制和有效药物筛选的基本方法之一[8]。H2O2是体内代谢的中间产物之一，大量积累会对细胞产生毒性作用，通过攻击细胞膜不饱和脂肪酸而改变细胞膜通透性，触发心肌细胞死亡[9]。本实验选择400 μmol· L-1浓度的H2O2作用于H9c2心肌细胞4 h，既可造成心肌细胞氧化应激损伤，又能较好地反映红景天苷的心肌保护作用。

试验结果显示，当H9c2心肌细胞受到H2O2氧化应激刺激时，细胞内的LDH、CK漏出增加，MDA释放显著增多。LDH、CK释放量的多少可以反映细胞膜的受损程度[10]，同时MDA是氧自由基ROS和细胞膜上多种不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产生的过氧化产物，MDA可以损害细胞膜，改变细胞膜的流动性和通透性，使细胞内外离子分布发生异常，进而抑制心脏功能，最终导致心肌细胞从可逆性的损伤发展为细胞死亡[11]。红景天苷预处理组LDH、CK以及MDA释放明显降低，同时细胞活力明显提高（P<0.05）并呈现浓度相关性，提示红景天苷可以降低心肌细胞脂质过氧化反应，表明红景天苷具有抗H9c2心肌细胞氧化应激损伤的能力，并与剂量呈正相关。同时，红景天苷能够升高抗氧化物酶SOD活性（P<0.05），而SOD是体内重要的抗氧化物酶，它的升高可以防止氧中毒以及缺血再灌注后引起的组织损伤，如减少局部缺血导致的毛细血管通透性增加、提前恢复受抑制的心肌收缩力等[12]。本研究还发现，与天然提取的红景天苷相比，合成红景天苷不仅具有比其更强的抗心肌细胞氧化损伤的能力，并且解决了天然提取红景天苷资源匮乏的问题，有望成为新一代的抗心肌缺血新药。

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Protective Effects of Synthetic Salidroside on H9c2 Cardiomyocytes Oxidatively Injured by H2O2*

XIAO Lu1,WANG Jing1,ZHU Ling-peng1,WANG Qiu-juan1,YAN Tian-hua1**,WANG Yan2,CAO Yong-bing2
1Department of Physiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2The Second Military Medical University,Chinese People's Liberation Army,Shanghai 200433

Objective：To investigate the protective effects of Synthetic Salidroside(Syn Sal)on H9c2 cardiomyocytes after oxidative stress of H2O2.Methods：H9c2 cardiomyocytes were culturedin vitroand divided into normal control group,model group,Extractive Salidroside(Ext Sal,10-4mol·L-1)pretreatment group and Synthetic Salidroside(Syn Sal,10-6,10-5,10-4mol·L-1)pretreatment groups.H9c2 cells were pretreated with vehicle or different doses of Sal for 24 h and then incubated with control or 400 μmol·L-1H2O2for another 4 h,then the cell viability,the activities of LDH,CK and SOD and the content of MDA were measured.Results：Compared with the normal control group,the viability of H9c2 cells and SOD were decreased,the activities of LDH and CK and the content of MDA were increased significantly(P＜0.01)in the model group.Compared with the model group,the viability of H9c2 cells and SOD were increased significantly,the activities of LDH and CK and the content of MDA were decreased significantly (P＜0.05)in Sal pretreatment groups,which was positively related with drug dosage.Conclusion：Salidroside pretreatment can obviously protect H9c2 cardiomyocytes from oxidative injury in a concentration-dependent manner,and the effect of Synthetic Salidroside is better than the Extractive Salidroside.

Synthetic Salidroside;Extractive Salidroside;H2O2;Oxidative stress;H9c2 cardiomyocytes

R965

A

1673-7806（2014）02-105-04

十二五重大新药创制项目（编号：2011ZX09102-002-01）

肖露，女，硕士生，研究方向：心血管药理学

E-mail:xiaolulucy@163.com

**通讯作者 颜天华，男，副教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学 E-mail:13016931191@126.com

2014-01-10

2014-02-23