血管内皮生长因子在促进颅骨缺损修复中的实验研究

韩金友　袁道英

【摘要】目的：探讨血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促进成骨缺损修复的机制。方法：雄性新西兰大白兔 24只，体重1.5～2.0 kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1cm×0.5cm全层骨缺损区，同时去除该区骨膜、保护硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧，植入复合PRP 的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。术后第2、4、8、12 周末分别处死兔6只取材。免疫组织化学法测定骨缺损修复区域血管内皮生长因子的表达； Image-proplus 5.0图像分析软件做VEGF表达强度的灰度测量。采用SSPS 16.0进行t检验统计学分析。结果：两组相比，在第2、4周时差异均有显著性（P <0.05），有统计学意义。结论：血管内皮生长因子在实验组早期阶段的强阳性表达，说明血管形成活跃。PRP促进骨修复的作用发生在植入后早期，启动了早期活跃的成骨。

【关键词】脱细胞骨基质；骨缺损修复；血管内皮生长因子；兔

【中图分类号】R651.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0010-01

骨缺损的修复是骨组织再生的过程，其基础则是伤口血管的形成和生长，血管的长入在组织修复中起着不可或缺的作用[1] 。修复过程中，在复杂的生物学调节机制作用下，各种各样的细胞因子在不同的骨缺损愈合階段发挥各自不同的功能。其中，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF） 是最重要的促血管生成因子[2] ，在骨缺损愈合过程中发挥重要的作用。本文以兔为实验对象，观察VEGF在骨缺损修复过程中的表达、分布及其促进成骨的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂

雄性新西兰大白兔 24只（山东大学医学院提供），质量1.5～2.0 kg。牛凝血酶（上海第一生化药业有限公司）；10%枸椽酸钠（济南天和化工有限公司）；10%氯化钙（济南天和化工有限公司）；ABM（上海市组织工程重点实验室）

1.2 兔颅骨缺损区制备

3%的戊巴比妥钠按1mL/kg兔耳缘静脉注射麻醉成功后，颅顶部备皮，手术区常规消毒铺无菌巾单。耳前眶后正中部位切开皮肤及皮下组织，于骨膜上向两侧分离皮肤及皮下组织，中线处切开骨膜，向两侧游离至拟制备骨缺损范围稍外处切除之。用牙科微动力牙钻分别于颅正中缝左右两侧约0.5cm处各制备1.0cm×0.5cm的颅骨全层缺损，制备过程中以无菌生理盐水降温，并注意勿损伤硬脑膜，冲冼术区碎骨屑，无菌盐水纱布覆盖。

1.3 PRP制备、活化及与ABM复合

0.15g无菌ABM颗粒置于无菌托盘待用。按Marx等[3]所介绍的两次离心方法制备PRP。耳中央动脉抽取全血5mL，注入预先放入0.3 mL枸椽酸钠的无菌试管，2500r/min离心10min，取上清液至中间层以下1mm处移至另一无菌试管，再次以3000r/min离心10min，弃去上2/3，余下的1/3为约0.5mL PRP。10%无菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制备成PRP活化剂溶液，2mL注射器吸取该溶液0.3mL，PRP 0.5ml和1ml空气，混匀后转移至ABM颗粒处并与之充分混合。静置1-2 min，混合物即成胶冻状。可见ABM颗粒均匀分布于胶冻状物质中，表示PRP活化并与ABM复合成功。

1.4 颅骨缺损修复及分组

随机选择一侧骨缺损作实验侧，植入复合PRP 的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。逐层缝合切口。常规饮食， 术后3 d 每天40 万U 青霉素肌注。分别于术后2，4，8，12周取材，暴露颅骨，去除骨缺损处粘连的软组织，在骨缺损周围0.5cm正常骨质处全层整块取下颅顶骨，冲冼标本，去除表面血污，放入4%多聚甲醛固定液中，4℃条件下固定24h。然后常规免疫组织化学染色，阴性对照：用PBS代替一抗工作液，重复以上操作。

1.6 VEGF表达强度结果观察

VEGF的阳性表达定位于胞质，呈浅黄色至棕黄色不等，随着表达强度的增高颜色加深。阴性：细胞无着色，阳性：细胞染成淡黄色，强阳性：细胞染成棕黄色。表达细胞包括成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞，新生血管内皮细胞等。实验组和对照组每侧标本随机选取6张VEGF免疫组织化学切片，在显微镜下取40倍视野，将图像采集入Image-proplus 5.0病理图像分析系统，每张切片观察5个视野，观察不同时间点两组骨缺损区域VEGF的表达强度情况。随机测10个阳性染色点灰度值，最后取平均灰度值，染色越深，灰度值越低。

1.7 实验数据的统计学处理

各组VEGF表达强度平均灰度值结果的对比采用SPSS 16.0统计学软件进行配对资料的t检验，结果用均数士标准差表示，以p <0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 VEGF在骨缺损修复中的表达强度灰度值

Image-proplus 5.0病理图像分析系统测量两组VEGF表达强度。结果显示，随着时间的延长，两组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。但实验组在2周至4周的时间区间内VEGF表达呈急剧下降，4周至8周至12周，下降趋于平缓。对照组在2周和4周时均呈强阳性表达。两组VEGF表达强度在2周和4周的差异有显著性（P <0.01） ，有统计学意义，而在8周和12周差异无显著性（P >0.05）。

3讨论

3.1兔颅骨骨缺损模型的建立

兔的头皮层较薄，颅骨易于显露，制备骨缺损手术操作相对简单易行，术区结构简单，相对安全。本实验参照多位学者成功的研究结果建立了兔颅骨骨缺损的模型，此种类型兔颅骨骨缺损，如果不加入干预因素，如植入移植材料等，不能达到自然愈合，最后只能以软组织瘢痕充填缺损区域[4，5] 。有了以上研究基础，本实验无需设计空白对照组。且本实验采用动物自身对照的设计方案，避免了由于动物个体差异造成的偏倚，提高了不同干预方法之间进行结果比较的可靠性。

3.2 采用的骨移植材料

目前，学者们公认的认为理想的骨充填材料应具备以下条件 [6，7] ：（1） 无毒、不影响正常生长发育等良好的生物相容性；（2）有一定的机械强度和良好的可塑性，（3）能够降解；（4）有一定的孔隙率。脱细胞骨基质（ABM）是对异体或异种动物的骨骼通过一系列生物化学方法处理，去除了基质中的细胞成分及间质大分子蛋白，而保留了骨组织的网架结构，其实质是骨脱细胞后的细胞外基质，是天然生物骨衍生材料的一种。其结构未发生变化，生物力学特性得以保留，具有天然的适合细胞、血管生长的三维网状结构、合适的孔径及孔隙率等[8]。

3.3 VEGF在修复骨缺损中的表达

伤口愈合和组织再生的基础是血管的形成和生长 [9]。学者们研究表明，骨折修复过程中血管生成抑制可导致类似人类萎缩性骨不连的纤维组织形成[10]。血管内皮生长因子（VEGF） 是最活跃的血管生长因子， 它与血管内皮上的特异性受体结合， 在促内皮增殖和血管生成的过程中发挥着非常重要和强大的作用。Mayr-Wohlfart等[11]等在体外培养人成骨细胞的实验中，用血管内皮细胞生长因子进行干预，结果成骨细胞的增殖能力提高了69%，这足以表明VEGF具有增强成骨细胞的分化增殖和成骨能力。还有学者通过研究发现[12]，在骨折愈合的不同阶段不同的组织细胞VEGF的都有不同程度的阳性表达， 而VEGF在正常骨组织内则没有表达。所以学者们一致认为，VEGF 在骨折修复过程中不同的表达程度体现了血供重建不同时期。实验研究还表明，VEGF骨创伤修复过程中在早期的血管生成阶段、后期骨痂结构形成、改建和矿化也有着高度活性表达 [12]。。因此，可以说VEGF 作为促使血管内皮细胞增殖、趋化的特异性细胞因子， 在骨修复过程中发挥着重要作用。

本实验发现：在骨缺损修复愈合的不同阶段， VEGF 基因的表达程度也是不同的。实验组在第二周时表达细胞为成骨细胞、吞噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等，这些细胞VEGF的表达呈强阳性，与对照组相比具有显著的差异性。然后，实验组和对照组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。实验组2周后的各种细胞VEGF表达强度呈明显降低，并逐渐趋于平缓。作者认为其机理为：在实验初期阶段，实验组PRP中含有大量的生长因子，成骨细胞、吞噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等表现VEGF的强阳性表达，具有迅速止血，减轻炎症，促使血管的形成及骨修复作用；而对照组由于无复合PRP，其过程仅是由于骨缺损局部出血、炎性细胞反应、血流中断等创伤因素因素引起VEGF的表达，表达强度比实验组弱，并且会一直持续到术后第4周左右。根据各组组织学形态表现和VEGF的表达情况，可以认为PRP促进骨修复的作用发生在植入后7至14天内。实验初期植入颗粒的严密包绕、形成大量的血管、伴以植入颗粒降解和炎症迅速消退等原因，都是后期骨修复的基础。

综上所述，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促进骨缺损修复的机制为： 第一，提供多种高浓度的生长因子：PRP与ABM复合为骨缺损的早期修复提供高浓度的血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor PDGF）、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β TGF-β）、VEGF、胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor IGF）等生长因子[13～15]。这些生长因子具有强大的促进成骨细胞增殖分化的能力。高浓度生长因子是机体内部自身修复系统的重要组成部分，所以它们能够在植入骨缺损后迅速参与到机体的修复过程之中，有力地促进了骨组织的早期愈合。 第二，形成成骨性修复的局部微环境。在本实验中，植入骨缺损ABM颗粒首先激活PRP，形成凝胶样物质，促使血小板释放生长因子。当这种凝胶状物质复合ABM颗粒植入骨缺损处时，会使受植床中的细胞处于含有较多生长因子的微环境中。凝胶状的形态具有的生长因子缓释效应，使血小板短期释放的生长因子能够在较长时间内持续而稳定地释放该处的微环境中。PRP复合ABM顆粒启动了早期活跃的成骨活动，有利于骨缺损的早期愈合和后期的成骨效果。

参考文献

[1] Kimura Takemoto T，Fujiwara Y，et a1.Esophageal perforation caused by a fish bone Treated with surgicallY Indwelling drainage and fibrin gluel injection for fistula formation.Ann Thorac Cardiovasc Surg.2012.[Epub ahead of print].

[2] Housner JA，Jacobson JA，Misko R.Sonographically guided percutaneous needle tertotomy for the treatment of chronic tendinosis [J].J Ultrasound Med，2009，28（9）：1187-1192.

[3] Foster TE，Puskas BL，Mandelbaum BR，el a1.Platelet-rich plasma：from basic science to clinical applications[J].Am J Sports Med，2009，37（11）：2259-2272.

[4] Lyras DN，Kazakos K，Agrogiannis G，et a1.Experimental study of tendon healing early phase：is IGF-1 expression influenced by platelet rich plasma gel？ [J].Orthop Traumatol Surg Res，2010，96（4）：381-387.

[5] Griffin XL，Smith CM ，Costa ML. The clinical use of platelet-rich plasma in the promotion of bone healing：a systematic review [J].Injury，2009，40（2）：158-162.

[6] Alsousou J，Thompson M，Hulley P，et a1. Th e biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery：a review of the literature[J].J Bone Joint Surg Br，2009，91（8）：987-996.

[7] Felgner PL， Gadek TR， Holm M， Roman R， Chan HW， Wenz M， Northrop JP， Ringold GM， Danielsen M.. Lipofection： a highly efficient， lipidmediated DNAtransfection proced. Proc NatAcadSciUSA，1987，84（21）：7413-7417

[8] Jungbluth P，Wild M，Grassmann JP，et a1.Platelet-rich plasma on calcium phosphate granules promotes metaphyseal bone healing in iniigs[J].JOnhopRes，2010，28（11）：1448-1455.

[9] ScalaM，GipponiM，MereuP，et a1.Regeneration ofmandibularosteoradionecrosis defect with platelet rich plasma gel[J].In Vivo，2010，24（6）：889-893.

[10] Kanthan SR，Kavitha G，Addi S，et a1.Platelet-rich plasma（PaP） enhances bone healing in nonunited critical-sized defects：a pre—liminarystudyinvolvingrabbitmodels[J].Injury，2011，42（8）：782-789.

[11] Baeyens W，Glineur R，Evrard L.The use of platelet concentrates：platelet-rich lasma（PRP）and platelet-rich fibrin（PRF）in bone reconstruction prior to dental implant surgery[J].Rev Med Brux，2010，31（6）：521—527.

[12] AntczakAJ，Vieth JA，Singh N，et a1.Internalization ofIgG-coated targets results in activation and secretion of soluble CD40 ligand and RANTES by human platelets[J].Clin Vaccine Immunol，201I，18（2）：210—216.

[13] Kreja L，Brenner RE，TautzenbergerA，et a1.Non-resorbing osteo clasts induce migration and osteogenic differentiation of mes-enchymal stemcells[J].JcellBiochem，2010，109（2）：347-355.

[14] Kim ES，Kim JJ，Park EJ.Angiogenie factor-enriched platelet-rich plasma enhances in vivo bone formation around alloplastic graft material[J].JadvProsthodont，2010，2（1）：7-13.

[15] Duan J，Kuang W，Tan J，et a1.Differential efects of platelet rich plasma and washed platelets on the proliferation of mouse MSC cells[J].Mol Biol Rep，2011，38（4）：2485-2490.