固相萃取—高效液相色谱法同时测定发酵豆制品中4种大豆异黄酮

旷勇　卢成瑛　龚竹琼　昌海

摘要[目的]采用固相萃取-高效液相色谱法同时测定大豆发酵制品中的异黄酮含量。[方法] 以乳酸、霉菌发酵大豆样品为试材，将发酵豆制品以60%的乙醇溶液超声波提取1 h，稀释后用SPE小柱做净化处理，以C18反相色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），0.2%甲酸和乙腈进行梯度洗脱、流速为1.2 ml/min、紫外检测波长260 nm，同时测定4种大豆异黄酮含量。[结果]试验得出，发酵豆制品中4种大豆异黄酮的平均回收率分别为大豆甙96.7%、染料木甙97.9%、大豆甙元102.2%、染料木素103.1%。[结论]该方法可同时测定发酵豆制品中4种大豆异黄酮成分，数据准确，重现性好。

关键词 固相萃取；高效液相色谱；发酵豆制品；大豆异黄酮

中图分类号S509.9；O657.7+2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01178-03

作者简介旷勇（1983-），男，湖南株洲人，工程师，从事天然食品添加剂产品研究开发。

大豆异黄酮（ISO）是大豆中的一类重要的非营养素成分，主要活性成分为葡萄糖甙-金雀异黄甙和大豆甙及其相应金雀异黄素（又称染料木素）和大豆素。经过研究，发现大豆异黄酮的生理活性有抗氧化、抗肿瘤、提高雌激素水平、减少动脉硬化、改善心血管功能、抗骨质疏松等功效[1-3]。并且有文献资料指出，大豆异黄酮中异黄酮甙元比异黄酮葡萄糖甙更容易被人体吸收[4-5]，同时，异黄酮甙元具有较强的抗氧化活性和对癌细胞增殖的特异性抑制作用，因此异黄酮甙元被认为是大豆异黄酮中具有预防和治疗癌症最有效的形式[6]。

发酵豆制品是湘西地区的一种传统发酵食品，并且有研究发现，发酵豆制品中异黄酮糖甙在微生物和酶的作用下大部分能转化为甙元[7-8]。但发酵豆制品中大豆异黄酮的测定方法还很少，虽有研究者进行发酵液中大豆异黄酮的糖甙类物质转化为甙元的测定[9-10]，但由于豆制品经发酵后成分复杂，使得样品中杂质去除率不高，对液相色谱柱损耗很大，并且分离度不好。笔者以乳酸、霉菌发酵大豆样品为研究材料，选用SPE固相萃取净化，以液相色谱梯度洗脱测定[11-13]，建立了一种分离度好、对色谱柱损耗小、能同时测定4种大豆异黄酮的检测方法。

1 材料与方法

1.1材料样品：经乳酸、霉菌发酵的豆豉及发酵前原料。主要仪器：LC20A岛津高效液相色谱仪；配有二极管阵列检测器；1/100 000天平；超声波清洗器；涡旋振荡器；样品捣碎机；高速离心机；固相萃取装置。标准品：大豆甙（纯度≥98%）、染料木甙（纯度≥98%）、大豆甙元（纯度≥98%）、染料木素（纯度≥98%），上海顺勃生物工程技术有限公司。主要试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙醇（分析纯）、超纯水。SPE小柱：CLEANUPCEC18156、美国SEPAX、500 mg/6 ml。

1.2标准溶液的配制 于1/100 000天平分别精密称取大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的标准物质为7.37、7.73、8.77、9.22 mg，用色谱纯甲醇定容至10 ml，至冰箱保存。使用时稀释成适当浓度的标准工作液。

1.3试验方法

1.3.1 样品的制备。将发酵豆豉置于玻璃培养皿内，于80 ℃烘箱烘至恒重，用组织破碎机捣碎，备用。将样品用捣碎机捣碎，准确称取约5 g左右的粉末样品，置于50 ml刻度试管中，先加入25 ml 60%的乙醇[14-15]，然后补加60%乙醇至40 ml的刻度，30 ℃，超声1 h。将超声好的样液，用60%的乙醇定容至50 ml，搖匀，倒出一部分样液于10 ml离心管，离心5 min（3 500 r/min）。准确移取1 ml上清液于10 ml容量瓶，用水定容至刻度，待上柱净化。

1.3.2 固相萃取条件的选择。试验选用C18小柱做除杂的净化处理。分别依次用纯甲醇（1 ml/次）、超纯水（3 ml/次）淋洗柱子，各3次，活化SPE小柱。移取5 ml稀释样液上柱，分别用5%、10%甲醇洗涤2次（3 ml/次），用刻度离心管收集滤出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，过膜待测。

另选用50%、60%甲醇洗涤2次（3 ml/次），再用纯甲醇冲洗，用刻度离心管收集纯甲醇滤出液，70 ℃氮吹，加1 ml 60%甲醇溶解，过膜待测。

1.3.3色谱条件。采用月旭C18反相色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），流动相为0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脱，流速1.2 ml/min，洗脱程序见表1。柱温为40 ℃，紫外检测波长260 nm，进样量10 μl。

2 结果与分析

2.1色谱条件的选择为很好地分离大豆甙和染料木甙、大豆甙元和染料木素，采用梯度洗脱程序。在洗脱条件的探索中，乙腈起始浓度分别选择了10%、15%、18%、20% 4个浓度。试验发现，起始乙腈浓度越低大豆甙和染料木甙分离效果越好，当起始乙腈浓度为10%时，大豆甙和染料木甙能达到良好的基线分离，且峰形尖锐。在分离大豆甙元和染料木素时，分别选择了乙腈渐变最大浓度为40%、45%、55%、60% 4个浓度，在乙腈浓度最大为45%时，样品中大豆甙元和染料木素既能达到很好的基线分离，又不会过长地延迟分析时间。

2.2标准曲线的配制分别移取母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，用50%的色谱纯甲醇定容至25 ml。按“1.3.3”色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围见表2。

2.3精密度试验取同一对照品溶液，按“1.3.3”色谱条件平行进样5次，测定4 种大豆异黄酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分别为0.65%、0.51%、0.81%、0.56%，说明仪器精密度好。

2.4重复性试验称取同一豆豉样品，加入同一浓度的标准溶液，按“1.3.1”和“1.3.2”样品处理方法做5份平行样品溶液，按“1.3.3”色谱条件进样，测定4 种大豆异黄酮含量，得大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分别为1.89%、2.13%、1.25%、0.96%，说明方法重复性好。

2.5稳定性试验取“2.4”重复性测试样品溶液1份，每隔3 h进一次样，测定峰面积，共测定6次，计算大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的RSD分别为1.35%、1.78%、0.88%、0.79%，说明该方法制备的溶液在18 h内稳定。

2.6检出限该试验以空白试剂的3倍基线噪音（峰高）所对应的待测组分的浓度为检出限，计算得出大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素的检出限分别是3.1×10-8、2.9×10-8、3.5×10-7、3.7×10-7 g/ml。

2.7固相萃取的结果在固相萃取试验中，分别依次选用6 ml 5%、10%甲醇溶液洗脱，测定各洗脱液中大豆甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素含量，试验结果见图1。由图1可以看出，5%甲醇洗脱液未有大豆异黄酮洗出，10%的甲醇洗脱液中含有大豆甙、染料木甙。因此，选用5%甲醇洗脱液洗脱水溶性杂质。

2.9发酵豆制品与豆制品原料的测定结果对比 选用8种经乳酸、霉菌发酵的豆制品及其豆原料依据该试验的方法进行测定，结果见表4。可以看出，黄豆原料经发酵后，糖甙类物質基本转化为甙元，发酵豆制品中甙元物质丰富，对人体有很好的保健作用。

3 讨论

发酵豆制品经微生物降解后，杂质多，在色谱柱上不易完全分离，且对色谱柱损耗大。该试验选用固相萃取，能很好地除去样品中的杂峰，使样品中目标成分能很好地分离，同时降低液相色谱柱的使用损耗。该试验采用梯度洗脱同时测定4种大豆异黄酮，能很好地分离大豆甙与甙元，为准确测定4种大豆异黄酮提供了检测依据。

通过对发酵豆制品在发酵前后的对比测定表明，豆制品经发酵后，糖甙类物质能很好地转化为甙元，更容易被人体吸收，是一类很好的保健食品。

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